實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)擬南芥和鹽芥谷胱甘肽過氧化物酶表達(dá)水平

趙寶添 孫娜娜 馬志媛 譚偉杰

谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是1957年由MillsRandle在牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。與動(dòng)物相比,植物中GPX研究起步較晚,1985年Drotar等報(bào)道在組織培養(yǎng)的菠菜、玉米、美國(guó)梧桐及水生藻類中檢測(cè)到該酶活性[1]。植物體中谷胱甘肽過氧化物酶的結(jié)構(gòu)和功能:植物GPX為非組成型表達(dá),但可受脅迫誘導(dǎo)。研究表明,表達(dá)GPXmRNA穩(wěn)態(tài)水平在不同環(huán)境脅迫下會(huì)有所上升,如病原體、高濃度的鹽、重金屬機(jī)械刺激或鉛毒等[2]。因此,GPX在植物氧化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能起重要作用。有報(bào)道指出,模式植物擬南芥GPX可能是潛在的解毒劑,可直接利用GSH為還原劑[3]。擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶家族有7個(gè)成員,分別專一定位于胞液、線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和質(zhì)外體等亞細(xì)胞器中(Milla,2002)。這些酶普遍存在且在非生物脅迫下受各種信號(hào)通路調(diào)節(jié),但目前這些酶在植物體中的功能并不完全清楚。利用模式植物擬南芥的多種突變體來研究GPX的功能,表明ATGPX具有雙重功能:首先可控制H2O2的穩(wěn)態(tài)[4];其次,轉(zhuǎn)導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2信號(hào),介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答脫落酸和干旱脅迫的氣孔調(diào)節(jié)[5]。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小鹽芥、擬南芥。

1.2試驗(yàn)方法

提取鹽芥、擬南芥總RNA,RT-PCR為CDNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

鹽芥GPX:5′引物TCGTCCTCTTCCTTTATCGACA ACG;3′引物CGCATCCTTCACGGTGAAATCATAG。

擬南芥GPX:5′引物TCTCTTCCAATTTCTACAACG GGA GC;3′引物CTTAGCATCCTTGACGGTGAAATCG。

反應(yīng)條件:94℃ 3min(94℃ 40sec;56℃ 30sec;72℃ 1min)30個(gè)循環(huán),72℃ 7min。

2結(jié)果與分析

由表1可知,擬南芥鹽激處理及對(duì)照:以肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參,2-△△CT值為2.776 626 901>1,表明擬南芥鹽激處理后,谷胱甘肽過氧化物酶表達(dá)有所上調(diào)且上調(diào)較多;鹽芥鹽激處理及對(duì)照:以肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參,2-△△CT值為0.915 945 29<1,表明鹽芥鹽激處理后谷胱甘肽過氧化物酶表達(dá)有所下調(diào)。

3討論

本試驗(yàn)把未經(jīng)鹽激處理的樣品作為參照因子,經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理后,通過2-ΔΔCT方法計(jì)算。根據(jù)定義,對(duì)于未經(jīng)處理的參照樣,△△CT=0,而20=1,即未經(jīng)處理樣本的倍數(shù)變化為1,而對(duì)于那些經(jīng)過處理的樣本,相對(duì)于參照因子基因表達(dá)的倍數(shù)為2-△△CT。出現(xiàn)這種結(jié)果有幾種可能:一是鹽處理的濃度過高,植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力,對(duì)植物造成傷害,從而使植物的基因組轉(zhuǎn)錄受到影響;二是植物為了防御鹽脅迫,適應(yīng)性地降低了植物基因組的轉(zhuǎn)錄,從而更有效地利用體內(nèi)資源;三是在鹽脅迫下谷胱甘肽過氧化物酶通過活性的升高對(duì)清除活性氧起到積極作用,通過表達(dá)谷胱甘肽過氧化物酶的方式提高耐鹽性;四是此次試驗(yàn)僅僅檢測(cè)了谷胱甘肽過氧化物酶同工酶中的1種,并不能代表全部的谷胱甘肽過氧化物酶情況,植物對(duì)鹽脅迫的耐受機(jī)制可能很復(fù)雜,還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 沈成國(guó).植物衰老生理與分子生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:57-58.

[2] 李曉燕,宋占午,董志賢.植物鹽迫生理[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào),2004(3):106.

[3] 徐文東,楊強(qiáng),徐志偉.谷胱甘肽及其相關(guān)酶在生物體內(nèi)的作用[J].福建熱作科技,1999(24):42.

[4] YUCHEN MIAO,DONG L V,PENGCHENG WANG.An Arabidopsis Glutathione Peroxidase Functions as Both a Redox Transducer and a Scavenger in Abscisic Acid and Drought Stress Responses[J].The Plant Cell,2006(18):2749-2766.

[5] 戚元成,張世敏,王麗萍,等.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因過量表達(dá)能加速鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2004(30):517-522.