大鼠骨骼肌挫傷后骨骼肌肌鈣蛋白Ｉ　ｍＲＮＡ的表達變化

[摘要] 目的 應用實時熒光定量PCR技術檢測大鼠骨骼肌挫傷后肌鈣蛋白I mRNA（sTnI mRNA）表達情況，分析其與挫傷的關系。方法 建立大鼠骨骼肌挫傷模型，分別在挫傷后0.5h，1h，6h，12h，18h取材。提取挫傷肌肉中的總RNA，逆轉錄合成cDNA第一條鏈，以cDNA作為模板，通過特異性上下游引物熒光定量PCR檢測cDNA的拷貝數，選取管家基因核糖體蛋白L32為參比基因，對擴增結果進行相對定量分析。結果 大鼠骨骼肌挫傷后0.5h、1h、6h、12h、18h 的sTnI mRNA表達量分別為正常組的66.7%、46.6%、31.9%、18.5%和15.3%，呈時序性表達下調趨勢。結論 大鼠骨骼肌挫傷后0.5h內sTnI mRNA的表達即開始下調，18h內sTnI mRNA的表達有一定的時間規(guī)律性，可望作為臨床診斷骨骼肌損傷的指標之一。

[關鍵詞] 骨骼肌損傷； 骨骼肌肌鈣蛋白I； 實時熒光定量PCR

[中圖分類號] R642 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-40-03

Expression of sTnI mRNA in Rat Skeletal Muscle after Contusion

ZHANG Lei SUN Junhong LU Jian WANG Yafang WANG Yingyuan

Department of Forensic Pathology，Shanxi Medical University School of Forensic Medicine，Taiyuan 030001

[Abstract] ObjectiveTo investigate the expression of skeletal troponin I mRNA（sTnI mRNA）changes induced by contusion in rat skeletal muscle using Real Time PCR，aimed to provide some help for forensic estimation of wound age. MethodsThe 36 rats were divided into two groups randomly：contusion group（5 subgroups） and control group，the contusion was performed on the right posterior limb of rat. The samples were extractd respectively at 0.5h，1h，6h，12h，18h after contusion. Total RNA were isolated from skeletal muscle of two groups，and reverse transcription polymerase chain reaction was conducted to synthesize the 1-st strand cDNA. With the use of sequence-specific primers，the expression level of sTnI mRNA was studied by Real Time PCR. ResultsOur results normalized by Ribosomal Protein L32（rpL32） showed that mRNA levels of sTnI were 66.7%，46.6%，31.9%，18.5% and 15.3% in contusion groups compared to control group respectively at 0.5h，1h， 6h，12h，18h，which present down-regulated after contusion within 18hs time-orderly. ConclusionThe time-order expression of sTnI mRNA after contusion was potentially indicative for diagnosis of early muscle injury.

[Key Words]Muscle injury； sTnI mRNA； Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

骨骼肌損傷以及骨骼肌疾病在臨床上頗為常見，進行快速準確的診斷十分重要。傳統(tǒng)酶學指標如CK、CK-MB等并非骨骼肌所特有，且缺乏敏感性和特異性，加之劇烈運動后也可導致血中CK、CK-MB的輕微升高，給骨骼肌損傷，特別是輕微損傷、多發(fā)性損傷的早期診斷帶來了不小的困難。sTnI與cTnI相似的特性，給骨骼肌損傷以及疾病的診斷提供了新的思路。

本實驗擬通過建立大鼠骨骼肌挫傷模型，采用實時熒光定量PCR（Real Time PCR）檢測大鼠骨骼肌挫傷后不同時間點骨骼肌肌鈣蛋白I mRNA（Skeletal troponin-I mRNA，sTnI mRNA）的表達量，探尋其時序性變化規(guī)律，旨在為骨骼肌損傷以及疾病的診斷提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器

總RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System）購自美國Promega公司；反轉錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit）及實時熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）購自大連寶生物工程有限公司；美國Stratagene公司Mx3005P實時熒光定量PCR儀；美國SIGMA公司低溫高速離心機2-16PK型。

1.2 實驗動物及分組

健康成年清潔級Sprague-Dawley大鼠36只，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。雌雄不限，體重（300±15）g，隨機分成6組，每組6只，包括5個損傷組（0.5h，1h，6h，12h，18h）和1個正常對照組。

1.3 動物模型制作及取材

1.3.1 動物模型制作 經口鼻乙醚麻醉大鼠，選取大鼠右后肢股四頭肌作為挫傷著力點，用本室自制的褪毛劑褪凈著力點附近約2.5cm×2.5cm區(qū)域的鼠毛，仰臥位固定于鼠板上，充分暴露打擊區(qū)域。利用改進的Marmarou自由落體裝置，250g重力錘自150cm高度垂直自由落下，造成大鼠右后肢股四頭肌處肌肉挫傷（解剖證實損傷率達100%）。

1.3.2 取材 大鼠存活至預定時間后迅速脫頸處死。打擊區(qū)域常規(guī)手術消毒后，無菌手術剪剪開皮膚及淺層肌肉，暴露股四頭肌損傷處，取材并嚴格稱重40mg，將檢材包裹好后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取及檢測

1.4.1 總RNA的提取 嚴格按照SV Total RNA Isolation System試劑盒說明進行操作。提取完畢后，取4μL進行紫外分光光度測定，5μL上樣電泳檢測完整性。

1.4.2 總RNA純度及完整性的檢測 紫外分光光度儀測定OD260/ OD280值在1.9～2.0之間，總RNA濃度約為230ng/μL；1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，可見清晰較亮的28s、18s兩條帶，28s寬度約為18s的兩倍，說明總RNA的完整性較好，符合后續(xù)實驗的要求，如圖1。

1.5 反轉錄體系及反應條件

模板總RNA進行65℃水浴5min變性后迅速冰上放置，同時按反轉錄試劑盒操作說明冰上配制反應混合液如下：5×PrimeScript Buffer 2μL，RT Enzyme Mix 0.5μL，Oligo dT Primer（50μM）0.5μL，Random 6mers（100μM）0.5μL，總RNA模板500ng，用Nuclease-Free水補足10μL反應體系。反應條件：37℃反應15mins，85℃滅活5s，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時熒光定量PCR

采用SYBR Green I 熒光嵌合法進行Real Time PCR。按照實時熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）操作說明冰上配制反應混合液如下：SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，Forward Primer（10μM）0.5μL，Reverse Primer（10μM）0.5μL，cDNA模板2.0μL， Nuclease-Free水9.5μL。選取內源性管家基因（House Keeping Gene）核糖體蛋白L32（Ribosomal Protein L32，rpL32）作為參比基因，反應體系同上。每組樣本均設空白對照及復管。目的基因與參比基因均按以下反應程序：第一階段：95℃，預變性，10min，1個循環(huán)；第二階段：95℃，變性，30s；60℃，退火、延伸20s，40個循環(huán)；第三階段為融解曲線繪制階段：95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。

目的基因及參比基因擴增所用上下游引物序列均引自GeneBank，由本室研究人員通過專業(yè)Primer5.0軟件設計優(yōu)化，經BLAST檢索確認特異性，委托上海Invitrogen生物技術有限公司合成，序列見表1。

1.7 數據分析和統(tǒng)計學處理

反應結束后，由StratageneMxPro QPCR軟件自動分析并輸出熒光定量結果。采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件對所得數據進行分析處理，應用單因素方差分析進行組間均數比較、Student-Newman- Keuls（SNK）法兩兩比較，P值小于0.05被認為兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1sTnI mRNA擴增曲線

各組樣本PCR過程基本都在第12個循環(huán)開始起峰，曲線拐點清楚，基線平而無上揚現象；指數期曲線斜率為1.05，表明擴增效率較高；各管的擴增曲線平行性好，表明擴增效率相近，如圖2。

2.2 sTnI mRNA融解曲線

擴增反應結束后，系統(tǒng)在55℃～95℃范圍內自動進行融解曲線的繪制。如圖3所示：各樣本融解溫度集中在88℃，融解曲線均為單一峰型，基底窄而峰高，表明并無引物二聚體等非特異性擴增產生。

2.3 sTnI mRNA相對定量結果

統(tǒng)計學分析顯示組內各樣本間兩兩比較的P值> 0.05，說明損傷后各樣本sTn I mRNA表達量的變化與個體因素無關；各取材時間sTn I mRNA相對含量各組間比較的P值< 0.05，各組間兩兩比較的P值< 0.05，說明大鼠骨骼肌挫傷后sTnI mRNA的表達量隨損傷時間的延長（18h內）逐漸下調具有統(tǒng)計學意義；而18h和12h兩組相比較其P值> 0.05，說明sTnI mRNA隨著損傷時間的延長，已經趨于一個低水平穩(wěn)態(tài)的表達，見表2。

2.4 大鼠肌肉挫傷后18h內sTnI mRNA表達量變化

大鼠肌肉挫傷后18h內sTnI mRNA表達量變化趨勢見圖4。

3 討論

骨骼肌肌鈣蛋白（Skeletal Troponin，sTn）是由C、T、I 3個亞單位組成的復合體，TnI亞基為單一多肽鏈，是肌肉收縮的分子開關，通過抑制細絲中的肌動球蛋白（Actomyosin）的ATP酶活性，抑制肌球蛋白（Myosin）與肌動蛋白的結合，進而阻止肌肉的收縮[1]。生理情況下極少有sTnI 釋放到血液中，只有當骨骼肌損傷、病變發(fā)生后，sTnI才會大量出現在循環(huán)系統(tǒng)中。研究證實sTnI的釋放與骨骼肌損傷類型及程度有密切關系，嚴重外傷會導致骨骼肌細胞骨架網（Cytoskeletal network）和收縮裝置結構（Contractile apparatus）的迅速崩解，TnI與肌原纖維分離，結合部分以固定形式存在的sTnI從肌纖維不斷崩解破壞而釋放，其本身及酶解片段進入血循環(huán)，造成血中sTnI濃度迅速升高[2-4]近年來，骨骼肌損傷的臨床診斷研究取得了一定的進展：Kiely[5]等利用酶免疫測定法對16例多發(fā)性肌炎（Polymyositis）和皮肌炎（Dermatomyositis）患者血清中sTnI、cTnI、CK、及CK-MB的濃度進行了測定。與對照組相比，sTnI、CK及CK-MB均顯著升高，而cTnI并未達到可檢出限濃度（0.03μg/L）。結果表明CK與CK-MB具有相關性（Spearman r = 0.99，P < 0.0001），同時sTnI與CK-MB間有相關性（Spearman r = 0.98，P < 0.0001），說明在骨骼肌炎性病變時，sTnI、CK及CK-MB均會大量釋放入血，但考慮到上述指標組織特異性時，認為sTnI較CK及CK-MB更具有診斷意義。Onuoha[6]等同樣利用酶免疫測定法（Immunoenzymometric assay）對16例骨折病人（包括脛腓骨、股骨、顱骨骨折等）和20例軟組織損傷病人（挫傷、扭傷、韌帶撕裂傷等）血漿中sTnI、CK-MB及彈性蛋白酶（Elastase）進行定量測定（患者無心臟疾病，且尚未進行外科治療），設對照組17例。結果表明骨折病人和軟組織損傷病人血漿中sTnI含量明顯升高，分別為（15.25±2.4）ng/mL及（10.41±1.8）ng/mL，明顯高于對照組（2.5±0.9）ng/mL水平且具有統(tǒng)計學意義，MB、Elastase濃度與對照組比較并無顯著性差異，同時，損傷組和對照組均未檢出cTnI。表明sTnI對骨骼肌損傷有診斷意義，且敏感性和特異性均優(yōu)越于CK-MB、Elastase等指標，并認為sTnI含量與損傷程度呈相關性。

本實驗觀察到大鼠骨骼肌挫傷后0.5h、1h、6h、12h、18h 的sTnI mRNA表達量分別為正常組的66.7%、46.6%、31.9%、18.5%和15.3%，呈時序性表達下調趨勢。其機制目前尚不清楚，作者推測在損傷早期以組織出血、水腫、壞死為主要改變時，機體啟動主動防御機制使sTnI mRNA的表達量下調，有利于受損的肌纖維保持收縮狀態(tài)，在一定程度上固定了損傷的范圍，避免了損傷的加重；也有可能在損傷早期，大量的炎性因子直接抑制了sTnI基因的表達。

急性嚴重創(chuàng)傷可直接造成患者骨骼肌變性及壞死，肌紅蛋白、酸性代謝產物、血管活性物質和組織毒素等大量釋放入血，而骨骼肌損傷誘發(fā)急性腎功能衰竭占創(chuàng)傷后急性腎功能衰竭的33.8%[7]，是導致急性腎功能衰竭的重要因素。本實驗利用Real Time PCR檢測到大鼠骨骼肌挫傷后早在0.5h內sTnI mRNA的表達即開始下調，18h內sTnI mRNA的表達有一定的時間規(guī)律性，對于臨床診斷骨骼肌損傷、推斷損傷時間，以便及時治療并預防骨骼肌損傷導致的急性腎功能衰竭有重要意義。

[參考文獻]

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[5] Kiely PD，Bruckner FE，Nisbet JA，et al. Serum skeletal troponin I in inflammatory muscle disease：relation to creatine kinase，CK-MB and cardiac troponin I[J]. Ann Rheum Dis，2000，59（9）：750-751.

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[7] 陳冬萍，莊海梅，邵瑛，等. 急性創(chuàng)傷嚴重骨骼肌損傷后腎功能損害的護理觀察[J]. 中華護理雜志，2007，10（42）：888-889.

（收稿日期：2009-01-02）