上海市腸炎沙門菌流行特征和分子分型研究

許學(xué)斌　袁政安　金匯明　肖文佳　顧寶柯　陳　敏　冉　陸　刁保衛(wèi)　崔志剛

(1.上海市疾病預(yù)防控制中心, 上海200336;2.中國疾病預(yù)防控制中心, 北京100050）

摘要[目的]分析上海市2006—2007年的腸炎沙門菌株，了解本地區(qū)腸炎沙門菌的分子流行病學(xué)特征。[方法]回顧2002—2007年腸炎沙門菌食品株的來源并與腸炎沙門腹瀉株作耐藥性比較；對(duì)2006—2007年全球沙門菌監(jiān)測(cè)（GSS）病例和食品分離的腸炎沙門菌進(jìn)行表型驗(yàn)證、藥敏試驗(yàn)和脈沖凝膠電泳（PFGE）分析。[結(jié)果]2006—2007年腸炎沙門菌在本市非傷寒沙門菌病例中列首位，而80%的食品株源自禽及禽肉制品，食品株的抗生素耐藥性高于腹瀉株。2007年腸炎沙門菌腹瀉株的耐藥譜和2006年有較大差異。包括13株食品株在內(nèi)共76株腸炎菌株可分為21種PFGE帶型，遺傳同源性接近80%，優(yōu)勢(shì)帶型依次為3型（34株）、1型（12株）、2型（5株）和5型（5株），除2型外均發(fā)現(xiàn)有與腹瀉株同型的食源株。2006和2007年的PFGE1/2型病例分別為4例和12例。[結(jié)論]上海市腸炎沙門菌病例和食用污染的雞肉等禽類制品有密切關(guān)系，PFGE3型腸炎沙門菌是目前上海市腸炎沙門流行株的優(yōu)勢(shì)菌型，2007年發(fā)現(xiàn)由鵝肝傳播的1/2型腸炎沙門菌可能是3型的變異株并有取代成為流行菌株的趨勢(shì)。開展對(duì)腹瀉病例和食物鏈的綜合監(jiān)測(cè)和以實(shí)驗(yàn)室為主的實(shí)時(shí)分子分型檢測(cè)能快速預(yù)警腸炎沙門菌散在爆發(fā)和追溯污染源。

［關(guān)鍵詞］腸炎沙門菌；脈沖凝膠電泳；分子分型；爆發(fā)；污染源

Study on the epidemiological character and molecular typing of Salmonella enterica serovar Enteritidis in ShanghaiXU Xue-bin1，YUAN Zheng-an1, JIN Hui-min1，XIAO Wen-jia1,GU Bao-ke1，CHEN Min1，RAN Lu2，DIAO Bao-wei2，CUI Zhi-gang 2（1.Shangahi Center of disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China；2.China Center of Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：［Objictive］ To study the molecular epidemiological characteristics of Salmonella enterica serovar Enteritidis（S. Enteritidis）strains in Shanghai from 2006 to 2007.［Methods］ A retrospective analysis from 2002 to 2007 was performed to explore the source of food-borne S. Enteritidis strains and compare its antibiotic resistance with strains isolated from diarrhea patients.Data of S. Enteritidis strains of patient and food of Global Salm-Surv(GSS) from 2006 to 2007 were tested;including phenotype confirmation,antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) analysis.［Results］S. Enteritidis was the topmost strains in diarrhea patients caused by non-typhi Salmonella in 2006 to 2007,in Shanghai. 80% strains of food-borne S. Enteritidis were obtained from poultry and its meat products.The antibiotic resistance of food isolates was higher than clinical isolates. The drug resistance spectrum of diarrhea patients isolates in 2006 was different from that in 2007.76 strains including 13 food-borne strains belong to 21 PFGE pattern combinations,and their genetic similarly was higher than 80%. The major PFGE subtype was 3(34strains),1(12 strains),2(strains)and 5(strains),Every strains from food has matched PFGE subtype strains in diarrhea patients except subtype 2. The number of homology case of diarrhea patients and food caused by subtype 1/2 were 4 and 12 in 2006 and 2007.［Conclusion］ There is close relation between the diarrhea patients of S. Enteritidis and the contaminated poultry(chicken) in Shanghai.The PFGE subtype 3 is the dominant epidemic strains.The PFGE subtype 1/2 isolated from goose liver in 2007 may be the virieties of subtype 3,and they may tend to replace the dominant strains.The study suggested that rapid control and forecast the potential outbreak cases of S. Enteritidis and trace the suspected contamination source by combine the surveillance of clinical patients and food chain,including the real-time molecular typing in laboratory.

Key words：S. Enteritidis; PFGE; Molecular typing; Outbreak; Contamination source

從1995年以美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）為主的多國、多部門合作建立的細(xì)菌分子分型國家電子網(wǎng)絡(luò)（PulseNet）監(jiān)測(cè)體系開始，由非傷寒沙門菌引發(fā)的許多公共衛(wèi)生事件就被各種傳媒廣泛報(bào)道而影響到全球范圍的相關(guān)食品貿(mào)易。作為我國經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易發(fā)達(dá)地區(qū)，上海于2006年加入非傷寒沙門菌的全球監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（GSS），完成2年的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌（血清型）是造成本市非傷寒沙門菌的感染性腹瀉病例和食源性疾病的優(yōu)勢(shì)菌型。為研究腸炎沙門菌在本市的爆發(fā)和流行趨勢(shì)，本研究通過對(duì)腸炎沙門菌食源株的回顧性分析和對(duì)2006—2007年GSS腸炎沙門菌腹瀉菌株進(jìn)行抗生素耐藥和脈沖凝膠電泳（PFGE）分析，以了解本市腸炎沙門菌的分子流行病學(xué)特征，為本市的非傷寒沙門菌監(jiān)測(cè)和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)菌株有2002—2007年食源性腸炎沙門菌48株和2006—2007年GSS病例分離的腸炎沙門菌84株；藥敏試驗(yàn)的腸炎沙門菌204株，包括2005年67株腹瀉株、2006年8株體檢株、2006—2007年84株GSS腹瀉株和45株食品株；PFGE分析腸炎沙門菌76株，包括2006—2007年GSS監(jiān)測(cè)的13株食品株和63株GSS腹瀉株；大腸埃希菌ATCC25922為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株；產(chǎn)超廣譜?-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯桿菌ATCC700603；本中心菌種保藏室提供的布倫登盧普沙門菌H9812作為PFGE的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.2培養(yǎng)基改良亞硒酸磺綠增菌液（MSBG）、羅伯特增菌液（RVS）、木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板（XLD）、CHROMagar?沙門菌顯色瓊脂平板（CAS）、M-H瓊脂平板均購自上?？片敿慰萍加邢薰荆c道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑由本中心供應(yīng)室配置。以上增菌液和平板均于避光10℃以下保存，在有效期內(nèi)使用。

1.1.3 試劑和儀器沙門菌分型診斷血清50種（成都生物制品研究所）、沙門菌分型診斷血清79種（S＆A，Ltd，泰國）；藥敏分配器和16種抗生素紙片：四環(huán)素（TET）、頭孢噻夫（EFT）、奧格門?。ˋMC）、氨芐西林（AMP）、復(fù)方新諾明（SXT）、環(huán)丙沙星（CIP）、氯霉素（C）、氧氟沙星（OFX）、萘啶酸（NA）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢噻肟（CTX）、甲氧芐氨嘧啶（W）、頭孢他啶（CAZ）、慶大霉素（CN）、磺胺甲異惡唑（S3）、鏈霉素（S）（Oxoid，英國）；Etest頭孢噻肟及頭孢噻肟含克拉維酸紙條和11種含抗菌藥物紙條（AB biodisk，瑞典）；VitekAM-60自動(dòng)生化鑒定儀和菌液比濁儀（生物-梅里埃，法國）；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ（TaKaRa，日本）；SeaKem Gold瓊脂糖（Cambraex Bio Rockland，美國）；脈沖凝膠電泳儀CHEF mapper system和凝膠成像系統(tǒng)GEL Doc2000（Bio-Rad，美國）；血清和抗生素紙片均在有效期內(nèi)使用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1食品樣品非傷寒沙門菌檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)方法［1］和2007年制定《上海市沙門菌病監(jiān)測(cè)方案》中食品檢測(cè)程序完成樣品處理、分離初篩、菌株鑒定和血清分型等，生化反應(yīng)符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鑒定為腸炎沙門菌。

1.2.2非傷寒沙門菌病例（GSS）監(jiān)測(cè)按照文獻(xiàn)方法［2］和《上海市沙門菌病監(jiān)測(cè)方案》中糞便樣品檢測(cè)程序完成對(duì)樣品分離、初篩鑒定和血清分型，生化反應(yīng)符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鑒定為腸炎沙門菌。

1.2.3抗生素敏感性試驗(yàn)參照CLSI（NCCLS）2005年操作規(guī)程采用改良K-B法并根據(jù)抑菌圈直徑判斷敏感（S）、中介（I）、耐藥（R），抑菌圈范圍在中介者并入R統(tǒng)計(jì)值； ESBLs菌株測(cè)試以頭孢噻肟作為初篩試驗(yàn)，抑菌圈直徑≤27mm者為疑似ESBLs，確認(rèn)試驗(yàn)使用Etest測(cè)試條檢測(cè)頭孢噻肟和頭孢噻肟-克拉維酸復(fù)合劑，若當(dāng)克拉維酸存在比無克拉維酸時(shí)的MIC降低大于4個(gè)稀釋梯度可判斷為產(chǎn)生ESBLs［3］。ESBLs菌株最低抑菌濃度（MIC）用Etest法測(cè)定11種抗生素。

1.2.4 PFGE按照GSS方案要求，在中國CDC國家腸道病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室按照PulseNet規(guī)定的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)76株腸炎沙門菌進(jìn)行凝膠電泳、圖譜分析和BioNumerics（Version 4.0）軟件聚類分析。

2 結(jié)果

2.1食源性腸炎沙門菌

從食品中分離腸炎沙門菌48株，包括2002—2005年的35株和2006—2007年的13株。其中來源于雞、鴨等禽肉制品為32株（80.0%，32/48），其次分別來源于豬、牛等畜肉制品8株、奶制品3株、豆制品2株、水果2株、蔬菜1株。

2.2GSS監(jiān)測(cè)腸炎沙門菌病例

2006年從GSS病例分離到腸炎沙門菌44株（22.4%，44/196），高峰期在8月；2007年從GSS病例分離到腸炎沙門菌40株（23.7%，40/168），高峰期在8、9月間。2年中腸炎沙門菌在非傷寒沙門菌腹瀉病例的血清型構(gòu)成中均占首位，2年內(nèi)與月度分離菌株數(shù)對(duì)應(yīng)的流行趨勢(shì)見圖1。

2.3腸炎沙門菌抗生素耐藥率

204株腸炎沙門菌分別來自腹瀉病人（151株）、體檢（8株）、食品（45株）。腸炎沙門菌臨床株對(duì)氟喹諾酮類的氧氟沙星、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明、氨芐西林、奧格門丁的耐藥率低于食品株，差異有顯著性（χ₂>3.8，P<0.05）；體檢株對(duì)大多數(shù)抗生素全部敏感，僅對(duì)四環(huán)素、利福平、鏈霉素、萘啶酸存在不同程度耐藥；食品株對(duì)萘啶酸、頭孢噻吩的耐藥低于臨床株，兩者差異有顯著性（χ₂>3.8，P<0.05），多重耐藥菌株的比例高于前兩者。臨床株耐藥率自2007年始發(fā)生較大變化，其中對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺甲異惡唑、鏈霉素的耐藥率出現(xiàn)了較大幅度的增高，對(duì)萘定酸的耐藥率則出現(xiàn)了下降（圖2）。有2株經(jīng)Etest篩選后確認(rèn)為ESBLs菌株分別是2006年的臨床株和食品株，對(duì)氨芐西林和第一代頭孢菌素（頭孢噻吩）的抑菌濃度大于256mg/ml，在第三代頭孢菌素中對(duì)頭孢噻肟和頭孢三嗪的抑菌濃度均大于256mg/mL，僅泰能敏感。禽肉株的耐藥值大于臨床株（表1）。

2.476株腸炎沙門菌株的PFGE分型

76株腸炎沙門菌共分為21種帶型。63株臨床株分15個(gè)帶型，優(yōu)勢(shì)帶型為3型（49.2%，31/63）和1型（17.5.0%，11/63），2型和5型各5株，4型、6型和34型各2株，其他型均僅有1株。1型與2型的差異較小，同源性達(dá)98%，與3型、4型也有90%的同源性。13株食源性菌株除1株自胡蘿卜、1株自豬肝分離外，其余11株有10株自雞肉制品分離，有1株自鴨肉制品分離。食源菌株的帶型分10種，和臨床株能完全匹配的型別有4個(gè)帶型（6株菌），分別是1型（1株）、3型（3株）、4型（1株）、5型（1株），其余6個(gè)帶型（7株菌）相對(duì)獨(dú)立。所有來源自病人和食品的腸炎沙門菌聚類圖譜顯示菌株間的遺傳同源性接近80%（圖3）。

3 討論

GSS是以腹瀉病例監(jiān)測(cè)為基礎(chǔ)重點(diǎn)針對(duì)非傷寒沙門菌引起的“散在爆發(fā)”案例開展相關(guān)的食源性溯源調(diào)查研究的全球合作項(xiàng)目，項(xiàng)目初始階段我們對(duì)方案和設(shè)立的監(jiān)測(cè)點(diǎn)完成對(duì)現(xiàn)場(chǎng)信息采集和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程的質(zhì)量控制和初步評(píng)估，隨后需要重點(diǎn)分析能造成“多點(diǎn)”或“局部”流行的個(gè)別優(yōu)勢(shì)血清型的分子流行病學(xué)特征［4］。腸炎沙門菌是最早發(fā)現(xiàn)能夠引起大規(guī)模食物中毒的非傷寒沙門菌血清型之一，也是近年我國沙門菌食物中毒爆發(fā)和流行案例的主要病原。從本次GSS報(bào)告的腸炎沙門菌株月報(bào)表所繪制的流行曲線觀察（圖2）：2006年本市監(jiān)測(cè)到的腸炎沙門菌檢出數(shù)頻率變化較大，高峰為12株，2007年的曲線變化小，但檢出高峰在流行季節(jié)持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長；從菌型構(gòu)成分析：2005年本市監(jiān)測(cè)的腸炎沙門菌株總數(shù)次于鼠傷寒沙門菌排第二位，而2006-2007年則超過鼠傷寒沙門菌排在首位，這種型別交替的現(xiàn)象通過2008年的GSS年度報(bào)告證實(shí)這在全球GSS網(wǎng)絡(luò)中具有共性特征。

高度散發(fā)的腸炎沙門菌株（病例）之間的關(guān)系以及是否可能和被污染的食品之間形成潛在的食源性危險(xiǎn)因素是本次個(gè)案研究的重要目的。基于GSS項(xiàng)目系統(tǒng)完整的菌株資源并整合本市非傷寒沙門菌血清型監(jiān)測(cè)的歷史數(shù)據(jù)回顧性分析48株食源性腸炎沙門菌：80%的腸炎沙門菌源于禽肉制品，特別是雞肉制品（包括超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的生鮮和冷凍、定型和非定型包裝產(chǎn)品）陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的食品。這種具有優(yōu)勢(shì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果至少說明在加工和銷售過程中頻頻被污染的雞肉制品是本市腸炎沙門菌病例的重要“媒介”，這為食品衛(wèi)生監(jiān)督部門如何對(duì)大型超市、集市及餐飲場(chǎng)所做好生鮮食品的分割或料理的安全控制管理和在企事業(yè)單位食堂或家庭宴請(qǐng)時(shí)強(qiáng)調(diào)“生熟分開”提供了科學(xué)的管理依據(jù)。

耐藥表型監(jiān)測(cè)在PulseNet監(jiān)測(cè)中的意義具體表現(xiàn)在—美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）通過收集分析食源和腹瀉菌株的耐藥率變遷來及時(shí)評(píng)估國內(nèi)外的食品株對(duì)本國沙門菌病發(fā)病率的影響。根據(jù)我們對(duì)非傷寒沙門菌的歷史耐藥監(jiān)測(cè)資料得到的結(jié)論，食源性沙門菌的耐藥率水平多高于臨床株，尤以萘啶酸和環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素較顯著，而臨床株的耐藥水平也不斷呈上升趨勢(shì)［5］。雖然本次腸炎沙門菌株的耐藥表型也基本具有過去的一些耐藥特征，但2007年腸炎沙門菌的臨床株對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺、鏈霉素耐藥水平升高的變化趨勢(shì)我們認(rèn)為是菌株發(fā)生了分子水平的變異并通過表型機(jī)制表達(dá)出的“拐點(diǎn)效應(yīng)”。相比之下，食源性腸炎菌株的耐藥率仍雖遠(yuǎn)高于臨床株的水平，但和既往的耐藥水平相比已有一定的下降，這在某種程度上反應(yīng)國家在動(dòng)物飼料及農(nóng)產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中對(duì)某些抗生素濫用所采取的積極控制措施初見效果。ESBLs沙門菌在中國已有多例被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，本次篩選的2株腸炎沙門菌其產(chǎn)生的CTX基因酶型和公共衛(wèi)生意義值得進(jìn)一步的研究［6］。

PFGE圖譜能闡述本地區(qū)的腸炎沙門菌分子水平的變化特征：腹瀉株和食品株之間存在共性和個(gè)性的PFGE型譜特征。63株腸炎沙門菌臨床株的優(yōu)勢(shì)型分別是3型（31/63）和1/2型（16/63），2006/2007年各有3株食品株（分別為雞肝、雞胸肉、豬心）與3型圖譜完全匹配；2007年有1株鵝肝株與1型圖譜完全匹配。其次，2006年的優(yōu)勢(shì)分子型為3型（15株），1型僅有4株；而2007年雖然也有16株為3型， 但1/2型則有12株，1/2型在2年中所出現(xiàn)型別的顯著性升高說明，PFGE3型在本地區(qū)腸炎沙門菌的絕對(duì)流行株中仍占主導(dǎo)，但是新出現(xiàn)分子變異的1/2型從2007年開始有逐步替代本地優(yōu)勢(shì)型的流行趨勢(shì)。同時(shí)該結(jié)論和流行病學(xué)特征、耐藥表型分析的結(jié)果變化之間形成相互驗(yàn)證。本次使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切所得PFGE圖譜與中國臺(tái)灣學(xué)者在1998-2002年的分型結(jié)果得到PFGE3型為優(yōu)勢(shì)分子型的結(jié)論一致，說明腸炎沙門菌PFGE3型在過去相當(dāng)長時(shí)間里其遺傳特征是穩(wěn)定的［7］。另比較GSS2008年度報(bào)告中廣東省的分型結(jié)果顯示，其2007/2008年的腸炎沙門菌的流行株亦為1/2型，和本市的分型特征一致。當(dāng)然，1/2型最終能否替代3型成為本地或在更大的范圍里成為流行株還需要我們繼續(xù)監(jiān)控和研究。

現(xiàn)階段我們離WHO-GSS要求監(jiān)測(cè)點(diǎn)對(duì)沙門菌病例進(jìn)行時(shí)實(shí)監(jiān)測(cè)的要求仍有較大差距。但是在2年中我們得到本市沙門菌的發(fā)病率等流行病學(xué)本底資料，大大提高監(jiān)測(cè)點(diǎn)現(xiàn)場(chǎng)人員的信息采集和流調(diào)能力，也幫助臨床實(shí)驗(yàn)室人員提高分離、鑒別沙門菌的能力和與現(xiàn)場(chǎng)人員的溝通能力；還初步證明禽肉制品可能是本市腸炎沙門菌病例的潛在傳染源，而PFGE圖譜證明鵝肝是本市2007年出現(xiàn)的腸炎沙門菌1/2型流行的傳染源。這些現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室結(jié)合的系統(tǒng)性研究模式為繼續(xù)做好項(xiàng)目的研究提供了可能的條件，所積累和得到的相關(guān)信息能服務(wù)和共享于本市的公共衛(wèi)生保障體系的建設(shè)和2010年世博會(huì)的衛(wèi)生保障活動(dòng)。

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項(xiàng)目基金：中美新發(fā)和再發(fā)傳染病項(xiàng)目資助［編號(hào)：美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）5U2GGH000018-02］

作者簡(jiǎn)介：許學(xué)斌（1972—），男，主管技師。（收稿日期：2008-12-24）