溶藻細(xì)菌H5對(duì)漢斯冠盤藻的溶藻特性研究

摘要：為了進(jìn)一步研究溶藻細(xì)菌H5的溶藻特性，采用透析、乙醇沉淀、有機(jī)溶劑萃取、酸堿穩(wěn)定性分析等方法探討了H5溶藻活性物質(zhì)的特性。結(jié)果表明，H5的溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～7.0 ku之間，不能用乙醇沉淀法完全分離，具有較好的親水性，在pH 4～7的酸性范圍內(nèi)溶藻能力較強(qiáng)。H5無菌濾液使?jié)h斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）藻細(xì)胞丙二醛含量顯著上升，SOD活力在處理0～196 h內(nèi)急劇上升，隨后下降，由此推測該活性物質(zhì)能使藻細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化，從而破壞了膜的完整性。

關(guān)鍵詞：溶藻細(xì)菌；溶藻活性物質(zhì)；溶藻特性；漢斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3011-04

富營養(yǎng)化已成為眾多水體普遍存在的環(huán)境問題。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，日益增加的工農(nóng)業(yè)污染連同大型水利建設(shè)可能使我國的許多河流的富營養(yǎng)化水平進(jìn)一步升高。自20世紀(jì)90年代以來漢江中下游及其支流多次暴發(fā)早春硅藻水華[1]；三峽工程建成蓄水后不久，香溪河、大寧河等主要支流庫灣每年春季暴發(fā)硅藻、甲藻水華[2]。水華發(fā)生時(shí)水色呈現(xiàn)褐紅色、或深或淺的醬油色，并伴有腥味，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)鼐坝^和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能[3]。面對(duì)日益嚴(yán)重的水華問題， 在物理、化學(xué)和其他生物方法除藻效果不甚理想的情況下，研究利用溶藻細(xì)菌防治水華和赤潮成為一個(gè)新的方向，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

溶藻細(xì)菌是水華或赤潮發(fā)生時(shí)伴隨的一類細(xì)菌，是一類以直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞細(xì)菌的統(tǒng)稱[4]。不少研究者認(rèn)為水華和赤潮的消亡都可能與溶藻細(xì)菌的溶藻功能有關(guān)[4，5]。近年來，國內(nèi)外對(duì)溶藻細(xì)菌的研究主要集中在溶藻細(xì)菌的分離、藻菌的相互作用和胞外分泌物對(duì)藻細(xì)胞的作用[5，6]，但對(duì)于胞外分泌物的性質(zhì)和溶藻作用機(jī)制缺乏深入研究。大多數(shù)溶藻細(xì)菌的研究都是針對(duì)藍(lán)藻水華[5-7]，而對(duì)于控制硅藻水華的溶藻細(xì)菌的研究則鮮見報(bào)道。

三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心水污染控制實(shí)驗(yàn)室前期從三峽水庫香溪河庫灣爆發(fā)硅藻水華的水體中篩選出1株溶藻細(xì)菌H5，并鑒定為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），其溶藻方式是間接溶藻，即分泌溶藻物質(zhì)于胞外，抑制藻類的生長。本試驗(yàn)通過進(jìn)一步研究溶藻細(xì)菌 H5對(duì)漢斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）的溶藻方式、胞外活性物質(zhì)的基本化學(xué)性質(zhì)和作用，以期為研制高效的生物化學(xué)除藻劑提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用藻種為漢斯冠盤藻，藻種經(jīng)活化后，在（15±1）℃、光照度為2 500 lx、光暗周期比12 h∶12 h的培養(yǎng)條件下，采用DM液體培養(yǎng)基[8]， 置于恒溫光照生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，間或振蕩。藻種的接種及傳代過程中均嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)則進(jìn)行。采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)漢斯冠盤藻細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，分離、純化和保種采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基[9]。

1.3 溶藻細(xì)菌H5無菌濾液的制備

取50 mL 溶藻細(xì)菌H5種子液加入到 450 mL LB培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，以20 000 g 離心30 min 收集上清液，上清液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾，并通過固體牛肉膏蛋白胨平板進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，得到H5無菌濾液。

1.4 溶藻能力的分析

溶藻能力的分析采用Kang等[10]的方法。無菌濾液、細(xì)菌培養(yǎng)液等試驗(yàn)組樣品按照1∶100的比例接入100 mL指數(shù)生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，對(duì)照組則加入相同體積的新滅菌的LB培養(yǎng)基到指數(shù)生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定各組漢斯冠盤藻濃度，然后計(jì)算殺藻率，殺藻率計(jì)算公式為：殺藻率=（1-試驗(yàn)組藻濃度/對(duì)照組藻濃度）× 100%。

1.5 溶藻活性物質(zhì)特性分析

1.5.1 活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小判定 活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小的分析采用李燕等[11]的方法，略作修改。將500 mL H5無菌濾液經(jīng)65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 mL，分別取10 mL裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.5 ku和7.0 ku的透析袋中，將透析袋放入蒸餾水中，以20 ℃、100 r/min振蕩透析48 h，透析期間每隔12 h 更換1 次蒸餾水。透析完成后，收集袋內(nèi)透析樣并用無菌水定容至 10 mL，將此透析樣經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后按體積比1∶100 接入100 mL 指數(shù)生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定殺藻率。

1.5.2 活性物質(zhì)乙醇沉淀分析 活性物質(zhì)乙醇沉淀分析采用李薔等[12]的方法，略作修改。將H5無菌濾液加入無水乙醇于4 ℃下靜置1 h，以4 000 r/min離心后分別收集上清液和沉淀。將收集的上清液經(jīng)65 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，再次加入無水乙醇沉淀，將上述步驟再重復(fù)1次。將收集的上清液再經(jīng)65 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用無菌水定容至50 mL，此部分為乙醇沉淀后獲得的上清液部分；將收集的沉淀用少量無菌水溶解并定容至50 mL，此部分為乙醇沉淀獲得的沉淀部分。將上清液組、沉淀組、H5無菌濾液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后按體積比1∶100接入100 mL指數(shù)生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定殺藻率。

1.5.3 活性物質(zhì)極性分析 活性物質(zhì)極性分析采用文獻(xiàn)[11]的方法。取3份50 mL的2倍無菌濃縮液，每份分別用100 mL石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯反復(fù)兩次進(jìn)行過夜靜置萃取，分別收集水相和有機(jī)相。水相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃真空蒸發(fā)掉殘留的有機(jī)溶劑；有機(jī)相經(jīng)65 ℃真空蒸發(fā)至干后，用少量蒸餾水溶解殘留固體。兩相分別經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用無菌水定容至相同體積，比較兩相的溶藻效果。

1.5.4 活性物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性分析 活性物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性分析采用文獻(xiàn)[12]的方法，H5無菌濾液用氫氧化鈉或鹽酸溶液分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，1 h 后調(diào)回原pH（7.2），經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后按體積比1∶100接入100 mL 指數(shù)生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d 后測定殺藻率。

1.6 丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

按照牛丹丹等[13]的方法測定MDA含量和SOD活性。即取一定量的漢斯冠盤藻藻液，在4 ℃下8 000 r/min離心收集藻細(xì)胞，加入少量磷酸緩沖液（pH 7.8）和石英砂在冰浴中研磨，勻漿液以4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液，立即使用或者保存在-70 ℃下備用，MDA含量的測定采用TBA法。

2 結(jié)果與分析

2.1 H5溶藻活性物質(zhì)的特性

2.1.1 活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小 采用透析的方法分析溶藻活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，結(jié)果見圖1。由圖1可知，10倍無菌濃縮液經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為7.0 ku的透析袋透析后，透析樣無溶藻效果；經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.5 ku 的透析袋透析后，透析液殺藻率與無菌濃縮濾液無顯著性差異（P>0.05）。因此，H5的溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～7.0 ku之間。

2.1.2 活性物質(zhì)的乙醇沉淀分析結(jié)果 H5的無菌濃縮液經(jīng)乙醇沉淀處理后，上清液組和沉淀組均有一定的溶藻效果，上清液組的溶藻效果明顯高于沉淀組（圖2）。而不管是上清液組還是沉淀組，其溶藻效果均不及原無菌濃縮液。在水溶液中，乙醇會(huì)使許多蛋白質(zhì)、核酸、多糖等多種物質(zhì)沉淀下來[14]，H5溶藻細(xì)菌的溶藻活性物質(zhì)不排除有上述物質(zhì)的可能，但是起主要溶藻作用的物質(zhì)不是上述物質(zhì)。

2.1.3 活性物質(zhì)的極性 H5的無菌濃縮液經(jīng)石油醚、四氯化碳和乙酸乙酯萃取后，水相都有較好的溶藻效果，有機(jī)相都無明顯的溶藻效果（圖3）。在上述 3 種有機(jī)溶劑萃取后所得的水相中，又以石油醚水相溶藻效果最好，殺藻率達(dá)到85.2%；四氯化碳次之；乙酸乙酯水相溶藻效果最差，殺藻率僅為56.1%，表明乙酸乙酯能萃取到少量的溶藻活性物質(zhì)，能抑制藻的生長，但抑制作用不強(qiáng)。據(jù)此判斷活性物質(zhì)為強(qiáng)親水性物質(zhì)。

3 種有機(jī)溶劑的極性由小到大為石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯，乙酸乙酯為中等極性的有機(jī)溶劑， 3種有機(jī)溶劑萃取到的脂溶性成分幾乎沒有溶藻活性，也表明溶藻細(xì)菌H5的活性物質(zhì)為強(qiáng)親水性物質(zhì)。

2.1.4 活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性 H5的無菌濾液在pH調(diào)至4.0～7.0，1 h 后再調(diào)回原值7.2，其代謝產(chǎn)物的溶藻活性不受影響，其殺藻率為86.4%～92.7%（圖4）。當(dāng)無菌濾液在pH為3.0或pH≥8.0，1 h后再調(diào)回原pH，代謝產(chǎn)物的溶藻活性大大降低，以致喪失。

2.2 H5無菌濾液對(duì)漢斯冠盤藻MDA含量和SOD活性的影響

H5無菌濾液對(duì)漢斯冠盤藻藻細(xì)胞MDA含量和SOD活性的影響見圖5。加入H5無菌濾液8 h后，藻細(xì)胞MDA含量增加40%，隨著時(shí)間的延長，MDA含量增加愈顯著，處理72、196、264 h后，MDA含量分別增加197%、496%和580%；加入無菌濾液8 h ，藻細(xì)胞SOD活力增加40%，處理72 h后SOD活力增加80%，處理196 h后SOD活力達(dá)到最大值，隨后又急劇下降。

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，H5的溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～7.0 ku之間。Nobuyuki 等[15]發(fā)現(xiàn)1株蠟狀芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻的溶藻活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在2.0 ku以下。李燕等[11]研究表明，蠟狀芽孢桿菌L8和短小芽孢桿菌L18產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻有溶藻作用，其溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～7.0 ku之間。溶藻細(xì)菌產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)中既有親脂性的、也有親水性的，還有的同時(shí)具有親脂和親水性[16]。本研究中溶藻細(xì)菌H5產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性。Nobuyuki等[15]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌N-14對(duì)銅綠微囊藻的溶藻活性物質(zhì)在堿性范圍內(nèi)非常穩(wěn)定，而在酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定性急劇下降。李薔等[12]報(bào)道1株芽孢桿菌B1的無菌濾液溶藻的最適pH為9左右。本研究中溶藻細(xì)菌H5產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)在酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定，而在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定性下降，表明本研究中的溶藻活性物質(zhì)可能是一種新的溶藻劑。

MDA含量是生物細(xì)胞膜脂過氧化的重要指標(biāo)，表明細(xì)胞膜完整性被破壞的程度[17]。本研究結(jié)果表明，在0～264 h內(nèi)MDA的含量始終處于增加的狀態(tài)，說明隨著無菌濾液處理時(shí)間的延長，藻細(xì)胞膜脂過氧化不斷加深，藻細(xì)胞的完整性被破壞的程度不斷加重，從而達(dá)到溶藻目的。SOD在生物抗氧化酶類中處于核心地位，它是第一個(gè)參與清除活性氧的保護(hù)酶[18]。藻細(xì)胞SOD活性在0～196 h內(nèi)不斷增強(qiáng)，表明藻細(xì)胞受到溶藻細(xì)菌的脅迫后，保護(hù)性反應(yīng)不斷升高，到達(dá)峰值后藻細(xì)胞受損，其保護(hù)性反應(yīng)又不斷下降。

綜上所述，溶藻細(xì)菌H5溶藻活性物質(zhì)具有分子量小、親水性強(qiáng)、能夠破壞藻細(xì)胞膜的完整性、在較廣的pH范圍內(nèi)活性穩(wěn)定等這些特性，都有利于其發(fā)揮溶藻作用。

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