Ｅ－選擇素基因多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

鄭維威　郭清江　張麗翠　蔡偉娟　劉　旻　吳雪花　黃瑾　謝建新　周祖釗　何　芳　馬雅靜　程　江

【摘要】 目的 探討E-選擇素(E-selectin)基因第2外顯子+G98T和第4外顯子+A561C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在新疆哈薩克族人群中的分布，并分析E-selectin基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)的分析方法，檢測(cè)了新疆哈薩克族人群無血緣關(guān)系的150例原發(fā)性高血壓患者和150名對(duì)照者E-selectin基因+G98T位點(diǎn)及+A561C位點(diǎn)多態(tài)性,同時(shí)用生化分析儀檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)。結(jié)果 ①新疆哈薩克族人群中E-selectin基因+G98T多態(tài)性位點(diǎn)存在GG、GT二種基因型，其中以GG基因型發(fā)生頻率最高(91.3%)，GT基因型頻率次之(8.7%)；同時(shí)也存在AA、AC二種基因型，其中以AA基因型發(fā)生頻率最高(88.0%)，AC基因型頻率次之(12.0%)；②E-selectin AC基因型在高血壓組和對(duì)照組間的分布差異存在顯著性(χ²=5.31，P<0.025)。結(jié)論 新疆哈薩克族人群中存在E-selectin+G98T和+A561C兩位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，其中A561C基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓具有相關(guān)性，C等位基因可能是新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓發(fā)病的遺傳易感基因。

【關(guān)鍵詞】 E-選擇素; 基因多態(tài)性；哈薩克族；高血壓

基金項(xiàng)目：新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：2005-07），石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：2009-03）

作者單位：832003石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄭維威 郭清江 張麗翠 蔡偉娟 劉旻 黃瑾 謝建新 周祖釗 何芳);

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(鄭維威 郭清江 張麗翠 蔡偉娟 劉旻 吳雪花 馬雅靜 程江);

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(黃瑾 謝建新 周祖釗);

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室(何芳)

Correlationof E-selectin gene polymorphisms in Xinjiang Kazak people with essential hypertension

ZHENG Wei-wei,GUO Qing-jiang,ZHANG Li-cui,et al.

Dept.of Clinical Laboratory,Shihezi University,Xinjiang 832008，China

【Abstract】 Objective To study the correlation of the +G98T polymorphism in the exon2 and the +A56lC polymorphisms in the exon 4 of E-selectin gene in Xinjiang Kazak people and the association with essential hypertension(EH). Methods Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) method was used to determine +G98T and S128R loeus mutation. Polymorphisms in E-selectin gene in 150 EH Patients and 150 controls. Automated Biochemieal Analyzer was used to measure the clinical biochemistry datas. Results ①Two genotypes AA and AC of E-selectin A561C polymorphisms，GG and GT genotypes of E-selectin G98T polymorphisms were found in Xinjiang Kazak people.②There was significant difference in frequencies of genotype in E-selectin A561C polymorphisms between essential hypertension and control group P<0.05.Conclusions E-selectin A561C amd G98T polymorphism exists in Xinjiang Kazak people. There is a correlation between E-selectin A561C polymorphism in Xinjiang Kazak people with essential hypertension.CAllele may be one of predisposing factor of Xinjiang Kazak people with essential hypertension.

【Key words】 E-selectin; Gene polymorphism;Kazak people; Hypertension

原發(fā)性高血壓是一種多基因、多因素綜合作用而導(dǎo)致的常見疾病,呈遺傳易感性與環(huán)境因素相結(jié)合的發(fā)病模式?，F(xiàn)研究熱點(diǎn)圍繞尋其相關(guān)基因展開,炎性反應(yīng)與自身免疫是否為高血壓的發(fā)病原因也引起了人們的關(guān)注。炎癥細(xì)胞因子E-選擇素(E-selectin) 及其部分基因多態(tài)性被證明與高血壓相關(guān),但E-選擇素第4外顯子A561C和第二外顯子G98T基因多態(tài)性對(duì)高血壓的影響報(bào)道不多,本文對(duì)其與新疆哈薩克族高血壓的相關(guān)性進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 高血壓組150例,男55例,女95例。來自新疆沙灣縣相對(duì)閉塞的牧區(qū)，經(jīng)過心血管科副主任醫(yī)師確診的高血壓患者,并排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病。均符合1999年WHO的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組:150例,男55例,女95例。均為健康體檢者,無高血壓病家族史,并進(jìn)行有關(guān)檢查排除了高血壓、心肌缺血、糖尿病等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑盒法抽提基因組DNA（試劑盒來自上海生工生物技術(shù)公司）,采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性( PCR-RFLP) 方法進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 提取人類基因組DNA,參考相關(guān)文獻(xiàn)^{［1，2］}設(shè)計(jì)一對(duì)引物(引物由上海生工生物公司合成)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增體系為25 μl,模板DNA2 μl,上下游引物各0.7 μl,10 ×Buffer2.5 μl,Mg2+2 μl,dNTPs0.5 μl,Taq-DNA 聚合酶0.3 μl (以上均由上海生工生物公司提供) ,雙蒸水補(bǔ)足至25 μl。應(yīng)用英國(guó)Hybaid Express全自動(dòng)PCR擴(kuò)增儀,先94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸10 min。

1.2.4 限制性核酸內(nèi)切酶酶切 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl,PstⅠ、HphⅠ(由上海生工生物公司提供) 2 μl ,10×Buffer 2 μl,雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。37℃水浴5 h進(jìn)行酶切反應(yīng)。

1.2.5 電泳判斷基因型及測(cè)序 酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣至含溴乙淀的3%瓊脂糖凝膠,120 V,電泳40 min后,在紫外燈下檢測(cè)照相,經(jīng)美國(guó)Kodak凝膠成像系統(tǒng)觀察片段電泳圖。對(duì)各基因型抽樣測(cè)序(送上海生工生物公司)核實(shí)基因型。

1.2.6 對(duì)照組及高血壓患者臨床生化指標(biāo)檢測(cè) 采用日立7170型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)清晨空腹肘靜脈血FBG、TG、TC、LDL 、HDL 、UA、CRE、ALT 等常規(guī)血液生化指標(biāo)。定標(biāo)物均為國(guó)外原裝試劑，保證線性范圍在控。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示。采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Hardy-Weinberg 檢驗(yàn)、OR 計(jì)算、基因頻率之間的比較采用四格表χ²檢驗(yàn);不同基因型的動(dòng)態(tài)血壓差異采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

E-選擇素(E-selectin)是黏附分子選擇素家族主要成員之一,為細(xì)胞表面糖蛋白,分子量為115 kD,由589個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,僅表達(dá)于細(xì)胞因子活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面,它是體內(nèi)的一種促炎細(xì)胞因子,參與多種白細(xì)胞，包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等以CD4⁺記憶性 T細(xì)胞亞群的黏附與聚集,它在免疫、炎性反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中起著重要作用^［3,4］。E-selectin基因位于第1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,為一段長(zhǎng)13 kb、DNA序列,含14個(gè)外顯子和13 個(gè)內(nèi)含子。有研究證實(shí) E-selectin基因第2 和第4 外顯子分別存在G/T和A/C多態(tài)性,這兩種多態(tài)性可能影響E-selectin基因表達(dá)和功能,并可能與心血管疾病有密切關(guān)系^［1,5］。

1994年德國(guó)學(xué)者Wenzel等^［6］首先證實(shí)E-選擇素第4外顯子基因中第561位堿基因腺嘌呤(A)P胞嘧啶(C)(A561C)的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致其分子128位氨基酸由絲氨酸(Ser)變成精氨酸(Arg)(S128R),這種基因多態(tài)性的存在可能影響E-選擇素基因表達(dá)和生物學(xué)功能,進(jìn)而影響到體內(nèi)E-選擇素的生物學(xué)作用。研究^［7］還發(fā)現(xiàn)E-選擇素水平與其基因型有關(guān),含C等位基因者E-選擇素水平高于含A等位基因者。由此猜測(cè),E-選擇素基因多態(tài)性可能影響其在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá),基因結(jié)構(gòu)的改變可能帶來蛋白質(zhì)功能的變化。

近來研究證實(shí)循環(huán)中炎癥細(xì)胞因子E-選擇素濃度與血壓有關(guān),而且E-選擇素Leu554Phe(L/F554)多態(tài)性、第2外顯子G98T基因多態(tài)性也與血壓有關(guān)聯(lián)^［8］。這明確表明炎癥細(xì)胞因子E-選擇素可以對(duì)高血壓產(chǎn)生影響。目前發(fā)現(xiàn)E-選擇素第4外顯子A561C基因多態(tài)性與非胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性^［9,10］。而且這種多態(tài)性已被證實(shí)與歐美白人CAD有關(guān)^［2］。E-選擇素A561C基因多態(tài)性在控制了諸多混雜因素的作用后仍是T2DM并發(fā)CHD可能的獨(dú)立危險(xiǎn)因子^［9］。其機(jī)制可能與A561C等位基因參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-選擇素有關(guān)。通過基因型的檢測(cè)篩查CAD的高危人群,將有助于早期發(fā)現(xiàn)和防治CAD及動(dòng)脈粥樣硬化。但其與高血壓的相關(guān)關(guān)系罕見報(bào)道。

本文首次報(bào)道了新疆哈薩克族E-選擇素第四外顯子A561C基因多態(tài)性和第二外顯子G98T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),E-選擇素A561C基因型構(gòu)成比在高血壓組與對(duì)照組之間有顯著性差異（P<0.025）,即C等位基因發(fā)生高血壓的風(fēng)險(xiǎn)性是A等位基因的2.063倍。但是E-選擇素G98T基因多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓沒有相關(guān)性，尚不能認(rèn)為T等位基因是新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓的易感基因。

推測(cè)E-選擇素A561C基因型對(duì)血壓的這些影響,可能源于第561位堿基因腺嘌呤A/胞嘧啶C的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致其分子128位氨基酸由絲氨酸變成精氨酸后,造成蛋白質(zhì)功能的變化,進(jìn)而影響E-選擇素基因在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)和生物學(xué)功能。由于循環(huán)中炎癥細(xì)胞因子E-選擇素濃度與血壓有關(guān),因此E-選擇素基A561C轉(zhuǎn)換可能改變了E-選擇素的分泌數(shù)量而導(dǎo)致高血壓。由于E-選擇素基因第四外顯子編碼E-選擇素表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域,發(fā)生在這一區(qū)域的A56lC轉(zhuǎn)換很可能會(huì)改變表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域,從而改變E-選擇素分子介導(dǎo)的黏附作用。進(jìn)一步由E-選擇素的分泌數(shù)量和黏附作用的改變?nèi)绾伟l(fā)展至高血壓,目前尚無定論。現(xiàn)推測(cè)可能與微循環(huán)異常有關(guān)^［11］。研究表明,微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的改變可能源于并促進(jìn)血壓增高。高血壓時(shí),小的阻力動(dòng)脈出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變與重塑,如管壁/管腔比值增大,不同血管床的毛細(xì)血管網(wǎng)變稀少。這些改變可通過增加外周阻力維持并促進(jìn)血壓的升高。有證據(jù)表明,在高血壓時(shí)觀察到的至少部分微血管的變稀薄與血管重構(gòu)、微血管生成減少有關(guān)^［12-14］。而E-選擇素影響著微循環(huán)的完整性,它在白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用已經(jīng)得到公認(rèn)。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附性增強(qiáng)反過來由于移動(dòng)聚集的白細(xì)胞產(chǎn)生的大量細(xì)胞素和酶促產(chǎn)物的作用,可導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的重構(gòu)等微血管改變。

在我國(guó),對(duì)于E-選擇素基因多態(tài)性的研究報(bào)道較少。本研究應(yīng)用PCR-RFLP的方法檢測(cè)了新疆哈薩克族E-選擇素基因A561C、G98T的多態(tài)性。在我國(guó)新疆哈薩克族人群中A等位基因頻率（89.7%）與德國(guó)（91.3%）^［15］、美國(guó)（84.6%）^［16］和英國(guó)（88.6%）^［9］沒有太大的差異，但與我國(guó)北京地區(qū)(97.8%)^［17］、武漢地區(qū)(97.0%)^［18］則有顯著性差異；G等位基因頻率（95.7%）與我國(guó)武漢地區(qū)漢族人群（92.5%）^［18］沒有顯著性差異。說明E-選擇素基因多態(tài)性分布在不同種族間存在差異。了解我國(guó)人群中E-選擇素基因多態(tài)性的分布,不僅為進(jìn)一步研究我國(guó)人群中高血壓的發(fā)生發(fā)展與E-選擇素基因多態(tài)性間的關(guān)系提供理論依據(jù),也將有助于更深入地理解高血壓在不同種族間所具有的不同發(fā)病率和臨床特點(diǎn)的基因背景。E-選擇素基因多態(tài)性與高血壓的研究才剛起步,還有待進(jìn)行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ Ellsworth DL, Bielak LF, Turner ST, et al.Gender and age dependent relationships between the E-selectin S128R polymorphism and coronary artery calcification. J Mol Med,2001,79:390-398.