正交設(shè)計(jì)優(yōu)選鉤藤堿的提取工藝

李曉云　葉小利　牛小花　李學(xué)剛　王立軍

（1.西南大學(xué) 藥學(xué)院藥用資源化學(xué)研究所，重慶 400715；2.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶 400716）お

摘 要：目的：優(yōu)化鉤藤中鉤藤堿的提取工藝。方法：以鉤藤堿得率為檢測(cè)指標(biāo), 采用L⁹(3⁴)正交試驗(yàn), 考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)影響因素, 采用高效液相色譜法進(jìn)行鉤藤堿測(cè)定。結(jié)果：提取次數(shù)和乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)檢測(cè)指標(biāo)均有顯著影響，提取時(shí)間影響不顯著。最佳提取工藝條件為90 %乙醇熱回流3 次, 每次3 h。結(jié)論：優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定、方法可行。

關(guān)鍵詞：鉤藤;鉤藤堿;正交設(shè)計(jì); 高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）01-0049-02

鉤藤為茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）、大葉鉤藤（Uncaria macrophylla Wall.）、毛鉤藤（Uncaria hirsute Havil）、華鉤藤（Uncaria sinensis〔Oliv.〕 Havi.）或無(wú)柄果鉤藤（Uncaria sessilifructus Roxb）的干燥帶鉤莖枝^[1]。具有清熱平肝，息風(fēng)定驚之功能。用于頭痛眩暈，感冒夾驚，驚癇抽搐，妊娠子癇^[1]。其主要有效成分為吲哚類(lèi)生物堿，具有降血壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜、抗癲癇以及對(duì)腦的保護(hù)作用^[2-3]。常規(guī)制劑中其有效成分的提取主要采用水煮濃縮法和70 %～75 %乙醇提取法^[4]，本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，采用乙醇回流提取法提取鉤藤中生物堿的正交試驗(yàn)優(yōu)化，對(duì)不同工藝總生物堿的提取率進(jìn)行考察，為鉤藤的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-6AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；藥材粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）。

鉤藤藥材購(gòu)買(mǎi)于重慶天圣奇仙藥業(yè)有限公司，經(jīng)作者鑒定為茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）；鉤藤堿對(duì)照品(購(gòu)買(mǎi)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，含量>99%)，甲醇為色譜純，水為超純水（經(jīng)Millopor溶液過(guò)濾系統(tǒng)處理），其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用L₉（3⁴）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平安排見(jiàn)表1。

2.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)取干燥至恒重的鉤藤粉末（過(guò)40目篩）50 g，精密稱(chēng)取9份，按1-9進(jìn)行編號(hào)，按照正交實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行操作。提取后再稱(chēng)定重量，分別用相應(yīng)濃度的乙醇溶液補(bǔ)足各編號(hào)樣品減失重量，搖勻，靜止，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液作供試品溶液。

2.3 鉤藤堿的測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水=55∶45（含三乙胺0.01moL/L，冰醋酸調(diào)pH=7.5）；流速1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=254nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫：30 ℃。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取鉤藤堿對(duì)照品2 mg，甲醇定容于10 mL容量瓶中，搖勻，得鉤藤堿對(duì)照品溶液，備用。精密量取上述對(duì)照品溶液50、100、200、400、800 μL，分別用甲醇定容至2mL，配制得系列對(duì)照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣（n=3），20 μL/次。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為：Y=561810X-412990，r=0.9999。結(jié)果顯示鉤藤堿在0.10～1.6 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積的RSD為0.95 %。結(jié)果表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制備的鉤藤供試品溶液,分別在0、2、4、8、10、12分別進(jìn)樣20μL。按照鉤藤堿對(duì)照品峰面積計(jì)算RSD為0.4%。表明供試品溶液中鉤藤堿在12內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取新制備的鉤藤供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鉤藤堿的含量,RSD為1.4%,表明重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知鉤藤堿（含量0.2232%）的鉤藤藥材供試品10份，每份約5.0g，分別精密稱(chēng)定；其中9份中每3份按80%、100%、120%水平加相應(yīng)質(zhì)量的鉤藤堿，另一份做空白對(duì)照，制備供試品溶液，分別測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為98.02%，RSD為1.21%。

2.3.7 樣品的測(cè)定

取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣（n=3），按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鉤藤堿的含量，測(cè)定結(jié)果按外標(biāo)法計(jì)算。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

色譜圖見(jiàn)圖1，正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

方差分析可知，影響鉤藤堿提取的主次因素為C＞B＞A,即乙醇的體積分?jǐn)?shù)＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。方差分析可知，B因素和C因素為顯著因素，A因素為不顯著因素，即提取次數(shù)和體積分?jǐn)?shù)對(duì)鉤藤堿的提取有顯著影響。最佳提取工藝為A3B3C3，即體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，提取時(shí)間3h，提取次數(shù)3次為最佳工藝。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱(chēng)取3份干燥的鉤藤藥材各20g，按最佳工藝進(jìn)行平行操作，測(cè)得提取物中鉤藤堿的平均含量為0.32%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明此方法可行。

3 討論

（1）鉤藤所含的有效成分為吲哚類(lèi)生物堿，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、苯等有機(jī)溶劑，難溶于水，因此采取提取后濃縮至無(wú)醇時(shí),加水生成沉淀，除去其中的水溶性雜質(zhì)。

（2）方差分析表明，提取次數(shù)和乙醇的體積分?jǐn)?shù)是影響提取效果的顯著因素，提取時(shí)間2h與3h的提取效果差別很小，而且要考慮到鉤藤堿、異鉤藤堿的熱不穩(wěn)定性^[5，6]，以及結(jié)合成本及時(shí)間問(wèn)題。因此在工業(yè)生產(chǎn)中，可以選擇90%乙醇，2h，3次的工藝條件。鉤藤生物堿具有多種藥理活性，尤其在降壓方面有著良好的應(yīng)用前景，該提取方法具有穩(wěn)定性好、鉤藤堿的得率高、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合于工業(yè)生產(chǎn)，為開(kāi)發(fā)鉤藤生物堿提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.2000 版（一部）.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

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［4］ 孫秀華.幾種藥材提取方法評(píng)析［J］.西北藥學(xué)雜志,1989,4(4):27.

［5］ 陳思蒔，付春梅，李章萬(wàn)，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定鉤藤中的鉤藤堿［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23（3）：355-356.

［6］ Tianjin Institute of Medicine．Study of Rhynchoph yJlines Extract and Pharmacist［J］．News of Chinese Herbal Medicine，1974,(4):8.

（責(zé)任編輯：陳涌濤）