ＨＰＬＣ研究藜蘆－丹參配伍后藜蘆定的含量

敖書華　劉　磊

（三峽大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，湖北 宜昌 443000）お

摘 要：目的：研究藜蘆藥材及丹參-藜蘆配伍后藜蘆主要化學(xué)成分的變化。方法：采用HPLC法測定藜蘆定的含量，比較配伍前后對二者的影響；色譜條件：Diamonsil-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-水-0.1M醋酸銨溶液（59∶1∶40），柱溫：25℃；檢測波長：220nm；流速：1mL?min^-1。結(jié)果：在0.292～1.460μg?mL^-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9998，n=5），平均回收率為95.17%，RSD=1.44%（n=5）；丹參配伍后藜蘆定的含量升高，顯示其毒性增加。結(jié)論：該方法簡便，標(biāo)準(zhǔn)客觀，可供參考。

關(guān)鍵詞：配伍；十八反；化學(xué)成分；丹參；藜蘆

中圖分類號：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0017-02

丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，主要含有丹參酮Ⅱ_A、隱丹參酮及丹酚酸B具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、養(yǎng)心安神等功效，在抗心腦血管疾病、抗衰老、抗腫瘤等方面有重要應(yīng)用。

藜蘆為百合科植物藜蘆的干燥根，主要功效為催吐、祛痰、殺蟲。主要含有生物堿類成分，其中以藜蘆定含量較多，小劑量時具有一定的降壓作用，而劑量較大時則成為一種脂溶性神經(jīng)毒素，能引起神經(jīng)肌肉興奮，心律不齊等。

目前研究“十八反”“十九畏”的綜述性文章較多，但從化學(xué)成分的角度研究“十八反”“十九畏”藥物配伍的較少，尤其在臨床上丹參和藜蘆屬于相反配伍，而關(guān)于兩者配伍的實(shí)驗(yàn)性研究尚未見報道。筆者在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用HPLC法對丹參、藜蘆各自單煎劑及二者的共煎劑中主要化學(xué)成分的變化情況進(jìn)行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex-P680液相色譜儀（德國戴安公司，四元泵，UVD170U檢測器，Chromeleon色譜工作站），AT-201電子分析天平（d=0.01mg，瑞士），SK5200H超聲波清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），北京醫(yī)用離心儀LD5-10，KMD型電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）。

1.2 試劑和試藥

藜蘆定對照品（verartidine，含量≥95%，美國chromadex公司，批號：94838-2007584），丹參酮Ⅱ_A對照品（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號：110766-200417），丹酚酸B對照品（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號：111562-200605），甲醇（美國Fisher公司，色譜純），已腈（美國Fisher公司，色譜純），醋酸銨（武漢市無機(jī)鹽化工廠，分析純），甲酸（上海振興，分析純），水為娃哈哈純凈水。其它試劑均為分析純。藜蘆（購于安徽省毫州滬譙飲片廠），經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室陳科力教授鑒定為百合科植物藜蘆的干燥根） 。丹參（購于湖北省中藥飲片廠），經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室陳科力教授鑒定為唇形科植物丹參的干燥根及根莖）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件

色譜柱：Diamonsil-C₁₈（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-水-0.1M醋酸銨溶液（59：1：40），柱溫：25℃；檢測波長：220nm；流速：1mL?min^-1。在本色譜條件下，理論板數(shù)按藜蘆定峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。藜蘆定峰與雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取藜蘆定對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.146mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

藜蘆單煎劑的制備：取藜蘆約10g，參照藜蘆丹參共煎劑的制備方法制備，即得藜蘆單煎液供試品。藜蘆丹參共煎劑的制備：取藜蘆和丹參各約10g，置圓底燒瓶中，加入80mL水，加熱回流3h，濾過，榨取藥汁，合并。置電熱套中濃縮至四分之一體積。加入甲醇20mL，超聲處理（功率150W，頻率20KHz）1h，取出，放冷，搖勻，離心30min，濾過，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以相應(yīng)的峰面積積分值對進(jìn)樣體積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：y=1.2369x-0.2490，（r=0.9998，n=5），線性范圍為0.292mg～1.460mg。

2.5 精密度試驗(yàn)

吸取上述對照品溶液5μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積積分值分別為5.7959、5.8669、5.6901、5.7767、5.5363、5.5365 RSD（n=6）=2.44％。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述供試品溶液，按上述色譜條件測定，于8h后測定，結(jié)果表明，供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率

藜蘆定對照品溶液的制備：取藜蘆定對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含1.26mg的溶液，即得。

加樣回收供試品溶液的制備：精密稱取已知含量的藜蘆藥材樣品5份，各約5g，分別精密加入上述藜蘆定對照品溶液1mL，照“供試品溶液的制備”下方法制備，制備加樣回收供試品溶液，照“藜蘆定測定條件”下依法測定，測得加樣回收率為95.17%，RSD為1.44%。結(jié)果見表1。

2.8 含量測定

（1）藜蘆單煎劑中的藜蘆定的含量測定：分別精密吸取藜蘆定對照品溶液和藜蘆單煎液供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，單煎劑中藜蘆定的平均含量為0.102mg?g^-1。

（2）丹參藜蘆共煎液中藜蘆定的含量測定：分別精密吸取藜蘆定對照品溶液和藜蘆共煎液供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，共煎劑中藜蘆定的平均含量為0.302mg?g^-1，RSD=0.76%（n=3）。見圖1。

從上述結(jié)果可以看出：丹參藜蘆共煎液中含有藜蘆定較高。說明丹參和藜蘆配伍后使毒性成分藜蘆定的含量增加，從而使藜蘆定產(chǎn)生的神經(jīng)毒素增加。

3 討論

（1）本課題主要從化學(xué)角度采用HPLC法研究丹參、藜蘆各自水煎液及二者的共煎液中藜蘆定的含量變化，發(fā)現(xiàn)丹參和藜蘆配伍后的毒性成分藜蘆定含量增加，使神經(jīng)毒素增加，對人體產(chǎn)生更大的危害。綜上所述，本研究為丹參反藜蘆提供了科學(xué)的理論依據(jù)，便于更好地指導(dǎo)中醫(yī)臨床安全用藥。

（2）單味中藥是一個復(fù)雜體系，難于分離和分析，配伍后化學(xué)成分的分離和分析就更困難了。因此建立一種重現(xiàn)性好的分析方法是研究中藥配伍的必要手段。我們建立了一套重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高的液相色譜分析方法來研究丹參藜蘆配伍后的共煎液中藜蘆定的含量變化，并且根據(jù)單煎液和共煎液中藜蘆定在相應(yīng)的保留時間處進(jìn)行了對比，由以上數(shù)據(jù)和圖譜可知配伍后藜蘆定色譜峰發(fā)生了含量上的變化。由此可以說明中藥配伍后的化學(xué)成分并非是單味藥化學(xué)成分的簡單加和，煎煮過程中復(fù)方有化學(xué)成分含量的變化。

（3）本文在對共煎液中藜蘆定進(jìn)行含量測定時，考察了供試品溶液在不同流動相體系下的色譜分離行為。曾以甲醇-水（60∶40）為流動相，柱溫：25℃；檢測波長：220nm；流速：1mL/min為條件進(jìn)行了研究，結(jié)果藜蘆定色譜峰的分離度沒有達(dá)到理想的要求，并且有拖尾現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，調(diào)整流動相比例，并且加入了醋酸銨改善峰形，最后確定了以流動相：甲醇-水-0.1M醋酸銨溶液（59∶1∶40），柱溫：25℃；檢測波長：220nm；流速：1mL/min的色譜條件，在此條件下，藜蘆定分離度達(dá)到了理想的要求，峰形左右對稱，各成分基本達(dá)到基線分離。

（4）在供試品溶液的制備時，為了跟臨床實(shí)際用藥相符合，模擬加水煎煮藥的方法和煎煮藥的時間，采用了直接用水加熱回流的方法，濾過，榨取藥汁。然后濃縮至四分之一體積，加入甲醇超聲處理1h進(jìn)行供試品溶液的制備。

（5）中藥成分非常復(fù)雜，同一成分在不同時間測定的色譜保留時間可能會有誤差，僅通過比較色譜保留時間來判別色譜峰的異同有可能產(chǎn)生誤判，若同時使用色譜峰保留時間或者采用指紋圖譜形式，可以考察更多化學(xué)成分的變化情況，提高判斷的準(zhǔn)確性。因此該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目還有待于進(jìn)一步地研究。

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（責(zé)任編輯：王尚勇）