ＰＴＥＮ、Ｐ１６、Ｒｈｏｃ基因表達(dá)與骨肉瘤的關(guān)系

王海濤　王洪光

摘 要:目的:研究PTEN、P16、Rhoc基因表達(dá)與骨肉瘤的關(guān)系。方法:選取20例骨肉瘤患者和20例骨軟骨瘤患者,用免疫組化SP法檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)P16、Rhoc mRNA的表達(dá)。結(jié)果:PTEN蛋白和P16 mRNA在骨軟骨瘤中的表達(dá)分別為123.00±9.26和0.80±0.02,顯著高于骨肉瘤中的57.75±8.30和0.36±0.11(P<0.05);Rhoc mRNA在骨肉瘤中的表達(dá)為0.93±0.04,高于骨軟骨瘤中的0.54±0.05(P<0.05)。結(jié)論:PTEN、P16、Rhoc與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān),且三者具有相關(guān)性。臨床上聯(lián)合檢測(cè)PTEN、P16、Rhoc的表達(dá)對(duì)骨肉瘤的早期診斷、預(yù)后判斷具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞:骨肉瘤;PTEN;P16;Rhoc

中圖分類(lèi)號(hào):R730.231+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-2197(2009)06-0018-02

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨原發(fā)性惡性腫瘤,好發(fā)于青少年,惡性程度高,預(yù)后差,是嚴(yán)重影響青壯年健康的惡性腫瘤。傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)切除、截肢加輔助化療,創(chuàng)傷大,存活率低。其病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚,因此,在基因水平上了解骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展,對(duì)于更好地選擇治療方法具有重要意義。我們運(yùn)用免疫組化法和RT-PCR法,檢測(cè)骨肉瘤中PTEN、P16、Rhoc的表達(dá)水平,探討其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,以期為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

骨肉瘤標(biāo)本分別來(lái)自20例骨肉瘤手術(shù)治療患者,其中男13例,女7例;年齡10-50歲,平均27.1歲。根據(jù)WHO骨肉瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),一般型10例,成軟骨型2例,成纖維型1例,血管擴(kuò)張型3例,髓內(nèi)高分化型1例,惡性纖維組織細(xì)胞瘤型1例,骨旁骨肉瘤1例,小細(xì)胞型1例;組織學(xué)分級(jí):高分化(Ⅰ～Ⅱ級(jí))14例,低分化(Ⅲ級(jí))6例。以同期收檢的20例骨軟骨瘤手術(shù)切除標(biāo)本作為對(duì)照。標(biāo)本于手術(shù)切下后分別置于液氮中保存;甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,3μm連續(xù)切片。

1.2 檢測(cè)試劑及方法

采用免疫組化SP法。鼠抗人PTEN單克隆抗體及SP試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每例均隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野,讀取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。根據(jù)登錄GenBank中檢索人P16、RhoC基因已知序列,應(yīng)用Priemer5.0軟件設(shè)計(jì)引物堿基對(duì)序列,由寶生物工程(大連)有限公司合成?？俁NA提取及逆轉(zhuǎn)錄和PCR各操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,指標(biāo)測(cè)定結(jié)果計(jì)量資料以x±s表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在骨肉瘤及骨軟骨瘤中的表達(dá)

PTEN陽(yáng)性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿,亦為棕黃色顆粒。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 P16、RhoC mRNA的表達(dá)結(jié)果

骨肉瘤組P16產(chǎn)物電泳條帶暗、產(chǎn)量低,RhoC產(chǎn)物條帶強(qiáng)、產(chǎn)量高。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

P16是一種新型抑癌基因,位于人類(lèi)染色體9P16區(qū),與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān),該蛋白是CDK4的抑制因子,通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白D1以競(jìng)爭(zhēng)方式結(jié)合CDK4,抑制CDK4的活性,使細(xì)胞停滯于G0期和G1期,抑制細(xì)胞分裂增殖。CDK4可能通過(guò)調(diào)節(jié)多種底物的磷酸化,是G1-S期和G2-M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵。體外研究證實(shí),P16蛋白能特異地抑制CDK4的活性。細(xì)胞周期蛋白D表現(xiàn)某種癌基因的作用,當(dāng)其過(guò)度表達(dá)時(shí),細(xì)胞便會(huì)向癌變發(fā)展。細(xì)胞周期蛋白D同CDK4結(jié)合時(shí),可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)分裂;P16與CDK4結(jié)合時(shí),致使其磷酸化活性降低,引起Rb磷酸化而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[1,2]?？梢?jiàn)P16既是細(xì)胞周期固有的調(diào)控者,又是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵成分。

PTEN基因位于人類(lèi)10q23,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,其活性的改變與多種腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。PTEN基因編碼的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,可負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路,對(duì)抗PI3K途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長(zhǎng)和生存信號(hào),抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。劉偉等[3]對(duì)43例非小細(xì)胞肺癌組織和20例癌旁正常肺組織PTEN表達(dá)情況的研究顯示,PTEN在肺癌組織中的表達(dá)率為46.5%,而在癌旁組織中的表達(dá)率為95.0%,兩組間比較有顯著性差異。Levine等[4]報(bào)道,在犬的骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中都可看見(jiàn)PTEN蛋白表達(dá)下降。

影響腫瘤細(xì)胞侵襲性的因素有很多,其中腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力是關(guān)鍵因素之一。許多實(shí)驗(yàn)均提示:腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力與侵襲性之間有密切關(guān)系[5],高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵蛋白是激動(dòng)蛋白,而RhoC又是調(diào)控激動(dòng)蛋白的關(guān)鍵基因。

本研究發(fā)現(xiàn),骨軟骨瘤中PTEN蛋白和P16 mRNA的表達(dá)顯著高于骨肉瘤;而骨肉瘤中的Rhoc mRNA表達(dá)則明顯高于骨軟骨瘤。這說(shuō)明p16和PTEN表達(dá)減低有可能使癌細(xì)胞獲得某種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),預(yù)示這些患者預(yù)后不良;而Rhoc表達(dá)增強(qiáng)說(shuō)明骨肉瘤細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力增加。

綜上所述,PTEN、P16、Rhoc與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān),且三者具有協(xié)同性。深入研究PTEN、P16、Rhoc的協(xié)同作用,將對(duì)骨肉瘤的預(yù)防、臨床治療及預(yù)后的判斷具有重要意義。

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[3] 劉偉,于文成,時(shí)衍同,等.PTEN在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2005,20(3):217-221.

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(責(zé)任編輯:曾楚華)