受體相互作用蛋白激酶-3參與甲型H1N1流感病毒感染小鼠記憶性CD8+ T細胞的應(yīng)答

秦波音，王超，劉洋，任曉楠，方鐘，李順，周曉輝

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

甲型H1N1流感病毒傳染性強、流行范圍廣，可引起高發(fā)病率和病死率的急性呼吸道傳染[1-2]。歷次流感大流行給全球公共衛(wèi)生、經(jīng)濟等諸多方面帶來重大影響，嚴重威脅人類健康[3-5]。

受體相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3)是RIPK家族中的重要一員，作為壞死復(fù)合體(necrosome)的關(guān)鍵成分之一介導(dǎo)細胞程序性壞死(necroptosis)的發(fā)生[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3在宿主抗病毒、細菌等感染進程及無菌性炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8]，但目前RIPK3對病毒特異性T細胞功能的影響尚不清楚。

CD8+T細胞在抗病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。根據(jù)表面分子CD44、CD62L可以將特異性CD8+T細胞分為下列亞群：CD44lowCD62Lhigh〔Naive T 細胞(TN)〕、CD44highCD62Lhigh〔中樞記憶性T細胞(central memory T cells, TCM)〕和CD44highCD62Llow〔效應(yīng)記憶性T 細胞(effective memory T cells, TEM)或效應(yīng)性T 細胞(effective T cells, TEff)〕。記憶靜息階段的TEM在遭遇再次感染后多數(shù)活化為TEff[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，流感抗原特異的效應(yīng)性CD8+T 細胞的生成、細胞因子的分泌和顆粒酶水平的表達都一定程度依賴于RIPK3分子，提示RIPK3在甲型 H1N1流感病毒株A/Puerto Rico/8/34 (簡稱PR8) 感染肺部的炎癥病理及誘導(dǎo)病毒特異的效應(yīng)性CD8+T細胞過程中發(fā)揮重要作用[10]。

然而，RIPK3分子在流感抗原特異的記憶性CD8+T細胞形成及記憶性應(yīng)答功能中的作用尚不明確。本研究利用RIPK3敲除小鼠的流感病毒感染模型，對RIPK3分子在記憶形成階段的特異性CD8+T細胞數(shù)量、功能及再次感染應(yīng)答中的作用進行了探討。

1 材料和方法

1.1 病毒

流感病毒PR8由上海市獸醫(yī)研究所的李澤君教授惠贈。在上海市公共衛(wèi)生臨床中心小動物感染實驗室(BSL-2)內(nèi)開展并完成動物感染實驗(上海市病原微生物實驗室備案憑證：金字第022015002號)。

1.2 實驗動物

SPF級2～4月齡C57BL/6野生型(WT)和RIPK3敲除(RIP3-/-)雌性小鼠各10只，動物體重為22～24 g。C57BL/6野生型小鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司〔SCXK(滬)2018-0006〕，RIPK3-/-小鼠由北京生命科學(xué)研究所王曉東教授惠贈。動物在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物中心SPF級動物設(shè)施內(nèi)進行飼養(yǎng)和繁育〔SYXK(滬)2015-0008〕，自由飲水和攝食，設(shè)施環(huán)境溫度為20～25 ℃，濕度40%～70%，照明為12 h明暗交替。嚴格按照上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物倫理委員會要求進行動物實驗操作(本實驗動物倫理審批號：IACUC2018-A044-02)。

1.3 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)、PBS(以色列Biological Industries公司)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、BI胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、1%青霉素和鏈霉素混合液(以色列Biological Industries公司)、紅細胞裂解液(美國BioLegend公司)、流式抗體(美國BioLegend公司)。異氟烷麻醉劑(上海雅培制藥有限公司)、BD Cytofix/Cytoperm Plus固定破膜試劑盒(美國BD公司)、高爾基復(fù)合體阻斷劑(美國BD公司)、針對主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子四聚體Flu.NP366〔ASNENMETM, H-2D(b)〕(廣州好芝生物科技有限公司)以及肽段NP366-374(ASNENMETM)和PA224-233(SSLENFRAYV)(蘇州強耀生物科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及小鼠攻毒將20只實驗小鼠從SPF飼養(yǎng)區(qū)轉(zhuǎn)入小動物感染實驗室內(nèi)預(yù)飼養(yǎng)1周，隨機分為4組，每組5只：WT感染組和WT未感染組、RIPK3-/-感染組和RIPK3-/-未感染組。小鼠使用異氟烷麻醉后，通過滴鼻方式進行病毒感染，置于負壓獨立通風籠具(individually ventilate cagesdul，IVC)內(nèi)飼養(yǎng)。感染組每只小鼠用40 μL含0.7×103TCID50(0.5倍LD50)的PR8/DMEM感染，未感染組采用等量生理鹽水代替。初次感染后第38天進行再感染，感染組小鼠每只先用40 μL含4.2×103TCID50(3倍LD50)的PR8/DMEM病毒液滴鼻感染，再用100 μL含9.8×103TCID50(7倍LD50)的PR8/DMEM病毒液尾靜脈注射感染。未感染組采用等量生理鹽水代替。

1.4.2 樣本采集及處理病毒初次感染后第37天和第41天(即再次感染前1 d和感染后第3天)，各組小鼠經(jīng)眼眶后眥靜脈叢采集抗凝血，加入10倍體積紅細胞裂解液，室溫避光放置15 min后，4 ℃ 、500 g離心5 min，棄上清液，用預(yù)冷PBS清洗1次，用1 mL R10(RPMI 1640培養(yǎng)基+10%滅活血清+1%青霉素和鏈霉素)重懸，細胞計數(shù)。

1.4.3 流感病毒特異性CD8+T細胞比例的檢測將外周血淋巴細胞與CD8-PB、CD44-APC、CD62L-PE-Cy7抗體和MHCⅠ類分子四聚體(Kb/NP366-PE)，4 ℃ 孵育45 min，加入150 μL的染色緩沖液，4 ℃、 300 g離心5 min，棄上清液， 200 μL染色緩沖液重懸細胞，濾膜過濾后上機檢測。所有數(shù)據(jù)用Flowjo(V10)軟件進行分析。

1.4.4 流感病毒特異性CD8+T細胞內(nèi)因子的檢測將外周血淋巴細胞與流感肽段NP366-374和PA224-233(濃度均為 2.5 μg/mL)混合后，加入高爾基復(fù)合體阻斷劑(濃度為 1 μg/mL)，37 ℃恒溫孵育5 h?；旌弦菏褂肅D8-FITC和CD44-APC抗體進行細胞表面染色，用BD Cytofix/Cytoperm Plus固定破膜試劑破膜，然后用IFN-γ-PE和TNF-α-PE-Cy7抗體進行細胞因子內(nèi)染色。每孔加入200 μL 預(yù)冷的PBS清洗1次，4 ℃ 、500 g離心5 min，棄上清液，渦旋振蕩器振蕩將細胞懸起。200 μL染色緩沖液重懸細胞，濾膜過濾后上機檢測，所有數(shù)據(jù)用Flowjo(V10)軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，組間比較采用非配對t檢驗方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIPK3敲除可導(dǎo)致小鼠流感病毒特異的記憶性CD8+ T細胞形成數(shù)量減少及其再次應(yīng)答階段的增殖數(shù)量降低

初次感染的小鼠在第38天進行再次感染，在再次感染前1 d和后3 d分別檢測外周血流感病毒特異性CD8+T細胞(圖1)。再次感染前即初次感染37 d后，WT和RIP3-/-小鼠流感病毒特異性CD8+T細胞均較未感染組增加，WT小鼠顯著高于RIPK3-/-小鼠。WT感染組：(1.51±0.17)%，RIPK3-/-感染組：(0.43±0.04)%，P<0.01(圖1A)。再次感染后的WT和RIPK3-/-小鼠流感病毒特異性CD8+T細胞均較對照組的增加，且WT小鼠仍顯著高于RIPK3-/-小鼠。WT感染組：(2.07±0.72)%，RIPK3-/-感染組：(0.85±0.08)%，P<0.05(圖1B)。以上數(shù)據(jù)提示，感染流感病毒PR8后，小鼠的RIPK3可能參與了記憶性CD8+T細胞的形成，因此，再次感染使得流感病毒特異性CD8+T細胞應(yīng)答水平更高。

2.2 RIPK3敲除可導(dǎo)致小鼠流感病毒特異的記憶性CD8+ T細胞在記憶靜息階段和再次應(yīng)答階段分泌IFN-γ等細胞因子能力減弱

再次感染前1 d和感染后3 d，分別取小鼠外周血分離淋巴細胞與流感NP和PA的CD8表位肽段體外孵育8 h，檢測流感病毒特異的CD8+T細胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細胞比例(圖2)。在再次感染前，WT小鼠流感病毒特異性CD8+T細胞中分泌IFN-γ的細胞比例顯著高于RIPK3-/-小鼠〔分別為(0.67±0.05)%和( 0.21±0.17)%，P<0.01〕(圖2A)；WT小鼠分泌TNF-α的細胞比例也顯著高于RIPK3-/-小鼠〔分別為(0.32±0.03)%和(0.12±0.01)%，P<0.01〕(圖2B)。再次感染后，WT小鼠流感病毒特異性CD8+T細胞中分泌IFN-γ的細胞比例高于RIPK3-/-小鼠〔分別為(0.67±0.11)%和(0.31±0.03)%，P<0.05〕(圖2C)；而WT小鼠分泌 TNF-α 的細胞比例與RIPK3-/-小鼠無差異〔分別為 (0.17±0.04)%和(0.17±0.02)%，P>0.05〕(圖2D)。結(jié)果提示，RIPK3對流感病毒特異的記憶性CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α能力均有影響。而在再感染后的記憶性應(yīng)答中，RIPK3的缺失導(dǎo)致了流感病毒特異性CD8+T細胞分泌IFN-γ細胞因子的能力降低，但對其TNF-α的分泌影響不明顯。

A: PR8 antigen specific CD8+ T cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from mouse: 1 day before re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. **: P<0.01. B: PR8 antigen specific CD8+ T cells in PBMC isolated from mouse：3 day after re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. *: P<0.05.

A: IFN-γ of PR8-specific CD8+ T cells: 1 day before re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. **: P<0.01. B: TNF-α of PR8-specific CD8+ T cells: 1 day before re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. **: P<0.01. C: IFN-γ of PR8-specific CD8+ T cells: 3 days after re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. *: P<0.05. D: TNF-α of PR8-specific CD8+ T cells: 3 days after re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group, P>0.05.

2.3 RIPK3敲除可導(dǎo)致小鼠流感病毒特異CD8+ T細胞再次應(yīng)答過程中 TCM 轉(zhuǎn)化成 TEff 或 TEM 能力減弱

為觀察小鼠再次感染后外周血CD8+T細胞的記憶/效應(yīng)表型，根據(jù)表面分子CD44、CD62L將特異性CD8+T細胞亞群進行區(qū)分(圖3A)。在再次感染后第3天檢測活化的 CD8+T 細胞記憶性細胞表型后發(fā)現(xiàn)，WT小鼠TEM的比例顯著高于RIPK3-/-小鼠〔分別為(15.90±4.25)%和(7.74±1.51)%，P<0.05〕(圖3B)；而WT小鼠外周血淋巴細胞中記憶性CD8+T 細胞亞群TCM比例顯著低于RIPK3-/-小鼠〔分別為6.90±0.65)%和14.55±0.78%，P<0.01〕(圖3B)；WT小鼠和RIPK3-/-小鼠的TN無統(tǒng)計學(xué)差異〔分別為(54.93±5.22)%和(63.02±2.65)%，P>0.05〕(圖3B)。該結(jié)果提示小鼠在再次感染流感病毒PR8后， RIPK3分子的缺失可能使TCM轉(zhuǎn)化成TEff/TEM的能力下降。

A: Analyses of mouse memory CD8+ T cell subsets by FACS. B: The third day after re-challenge, WT group compared to RIPK3-/- group. TEM*: P<0.05, TCM **: P<0.01.

3 討論

免疫記憶是一種極為重要的生命現(xiàn)象，是獲得性免疫的重要組成部分，也是疫苗能否有效的關(guān)鍵。人體在感染流感病毒后，免疫系統(tǒng)會通過樹突細胞或巨噬細胞等抗原呈遞細胞來激活流感病毒抗原特異性CD8+T細胞，后者可殺傷被病毒感染的呼吸道上皮細胞和肺實質(zhì)細胞，最終清除病毒[11-13]。而在病毒清除后，有5%～10%的效應(yīng)細胞可以作為記憶性CD8+T細胞長期存活。當發(fā)生繼發(fā)性流感病毒感染時，這些細胞能夠快速活化發(fā)揮高效特異的抗病毒作用[14-15]。但抗原特異性CD8+T細胞免疫記憶形成和維持的分子機制至今尚未完全闡明。

RIPK3是細胞程序性死亡的關(guān)鍵分子，但在CD8+T細胞活化和記憶中的作用缺乏研究。本課題組前期工作表明，在感染流感病毒PR8后，流感抗原特異的效應(yīng)性CD8+T細胞的生成和功能都一定程度依賴于RIPK3分子[10]。本研究繼續(xù)探索了RIPK3分子在流感抗原特異的記憶性CD8+T細胞形成及再次遭遇抗原記憶應(yīng)答中發(fā)揮的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠在初次感染流感病毒5周后，小鼠體內(nèi)仍存在一定數(shù)量的NP抗原特異性CD8+T細胞，表明感染流感后小鼠CD8+T細胞能形成記憶效應(yīng)(圖1A)。但在RIPK3敲除小鼠體內(nèi)抗原特異性CD8+T細胞數(shù)量顯著低于野生型小鼠(圖1)。通過這些T細胞對流感NP 和PA肽段刺激的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)記憶階段的野生型小鼠中CD8+T細胞分泌細胞因子IFN-γ和TNF-α的能力顯著高于RIPK3敲除鼠(圖2A、2B)。這一結(jié)果說明RIPK3在抗原特異的記憶性CD8+T細胞形成中發(fā)揮重要作用。

本文進一步研究了C57BL/6小鼠特異性CD8+T細胞對流感病毒再次感染的記憶應(yīng)答情況。C57BL/6小鼠在再次感染流感病毒后第3天均檢測到較初次感染更多的NP抗原特異性CD8+T細胞及更高比例的IFN-γ表達細胞(圖2C)；但RIPK3敲除小鼠體內(nèi)抗原特異的記憶性CD8+T細胞數(shù)量及其記憶性應(yīng)答表達IFN-γ的能力仍然顯著低于野生型小鼠(圖2C)。說明RIPK3在抗原特異的記憶性CD8+T細胞的再次應(yīng)答功能中依舊發(fā)揮重要作用。

當流感病毒感染宿主后，天然CD8+T 細胞(TN)可誘生出抗原特異的效應(yīng)性CD8+T細胞，并進而可分化為記憶性CD8+T細胞，后者可分為TCM和TEM亞群[9]。當再次被感染時，TEM可快速活化成TEff，遷徙至外周感染部位，發(fā)揮抗病毒記憶應(yīng)答作用，起到快速執(zhí)行效應(yīng)功能的作用；而TCM則歸巢至次級淋巴器官的T細胞區(qū)，幾乎不發(fā)揮效應(yīng)性功能，但能穩(wěn)定增殖[9]。與天然T細胞相比，TCM對抗原刺激更加敏感，在抗原刺激增殖后可分化為效應(yīng)細胞TEff，產(chǎn)生大量IFN-γ等效應(yīng)細胞因子[9]，還可以在一定程度上分化成TEM[16]，而兩者的差異則顯示出免疫記憶的高度復(fù)雜性。對流感抗原特異的記憶性CD8+T細胞TCM和TEM亞群分析發(fā)現(xiàn)，病毒再次攻擊時RIPK3敲除小鼠體內(nèi)TEM比例顯著低于對照，而TCM比例顯著高于對照(圖3B)。TCM主要分布在淋巴結(jié)和扁桃體等次級淋巴器官，而TEM主要在肺、肝和腸等外周組織，在外周血中TCM和TEM的相對比例是變化的。有研究報道TN、TCM和TEM之間可以存在一定的轉(zhuǎn)化關(guān)系[17]，TCM可以在一定程度上分化為TEM或TEff，而TEM則只能分化成TEff[11]。本研究并未發(fā)現(xiàn)RIPK3敲除對TN有影響，而TCM和TEM則出現(xiàn)一升一降的改變(圖3)。推測可能是病毒再次感染小鼠時，缺失RIPK3分子可能使得TCM轉(zhuǎn)化成為TEff/TEM的能力下降，從而TCM相對更高，而TEff/TEM比例降低。

綜上所述，本研究初步探討了RIPK3參與調(diào)節(jié)流感抗原特異的記憶性CD8+T細胞生成數(shù)量及分泌IFN-γ細胞因子的能力，發(fā)現(xiàn)RIPK3能夠調(diào)節(jié)流感病毒再次感染后TCM和TEM/TEff的比例。但該結(jié)果基于在基因敲除小鼠中觀察到的RIPK3參與調(diào)控記憶性CD8+T細胞的現(xiàn)象，尚無法甄別是由于CD8+T細胞本身缺失RIPK3分子導(dǎo)致的還是由于其他輔助細胞如抗原呈遞細胞中RIPK3的缺失導(dǎo)致的。擬在條件性敲除小鼠及過繼性轉(zhuǎn)移等實驗中做進一步的深入探索。