嶗山茶樹病害種類調(diào)查與生防菌的篩選研究

羅　蘭　袁忠林　孟昭禮　江崇煥　彭正云

摘要對嶗山茶樹病害種類進行了調(diào)查，同時以茶云紋葉枯病為靶標菌進行生防菌的篩選研究。調(diào)查結(jié)果表明，嶗山茶場的主要病害為茶云紋葉枯病、茶赤葉病和茶輪紋病；從茶樹上分離得到5種生防菌，對茶云紋葉枯病菌均有一定的抑制作用，初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus spp.），為茶園病害的防治提供了新途徑。

關(guān)鍵詞茶樹；病害種類；調(diào)查；拮抗細菌；篩選

中圖分類號 S435.711 文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2009）03-0112-02

茶葉是人們喜歡的健康飲料，具有清心明目、生津止渴的功效，是世界三大飲料（可可、咖啡、茶葉）之一。中國茶葉種植面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第二，品質(zhì)第三，創(chuàng)匯第四。造成這種狀況有多種因素，農(nóng)藥的不合理使用是農(nóng)藥殘留超標的主要原因。而農(nóng)藥殘留是當前茶葉出口創(chuàng)匯最大的衛(wèi)生質(zhì)量問題[1]。要解決茶葉中農(nóng)藥殘留問題，根本措施是合理使用化學農(nóng)藥防治茶園病蟲害，研制高效、無公害農(nóng)藥。而科學使用農(nóng)藥的前提是了解當?shù)夭鑸@的病蟲害的發(fā)生情況。嶗山綠茶產(chǎn)區(qū)地處嶗山山脈，具有獨特的地域特點，緯度高，受海洋氣候影響較大，形成嶗山綠茶特有的品質(zhì)，味濃、香高和耐沖泡等顯著特點，深受消費者的歡迎[2，3]。同時嶗山的氣候特點，也決定了茶園病害的發(fā)生特點。筆者對嶗山茶樹病害種類進行調(diào)查，旨在摸清本地茶樹病害的種類，以期為茶園病害綜合治理提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1茶園病害種類調(diào)查

在茶樹生長季節(jié)，采取隨機調(diào)查的方法，在茶園采集病害標本，并記錄病害危害部位及發(fā)生程度，參考相關(guān)文獻進行茶樹病害種類鑒定[4，5]。

1.2茶樹主要病害病原菌的分離與鑒定

根據(jù)病害癥狀，采集病葉，按常規(guī)方法分離病原菌，即在病葉的病健交界處取2~3mm組織塊，每病斑3~5塊置于培養(yǎng)皿中用70%的酒精消毒30~60s，然后用無菌水洗凈3~4次。經(jīng)無菌吸水紙吸去多余水分，置于PDA上25℃培養(yǎng)，2d后檢查分離情況，并進一步純化。依據(jù)培養(yǎng)性狀、形態(tài)觀察和致病性確定病原菌，斜面保存?zhèn)溆肹6]。

1.3拮抗菌的分離與純化

采集不同品種（龍井、福安和福鼎）茶樹的根、莖、葉等組織切碎，稱量10g放到盛有90mL無菌水的三角瓶中，振蕩30min后，再依次稀釋為10-2、10-3、10-4等3個濃度梯度，每個濃度重復3次。在NA上培養(yǎng)48h后觀察，挑取不同形態(tài)、色澤、大小的菌落在NA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到斜面培養(yǎng)基上保存，備用。

1.4拮抗菌的篩選與初步鑒定

將純化后的細菌分離物在NA平板上28℃培養(yǎng)24h，用雙向平板對峙法篩選對茶樹云紋葉枯病菌有拮抗作用的細菌。在PDA平板的四周接上細菌分離物，平板中央接種培養(yǎng)48h，茶樹云紋葉枯病菌菌絲塊直徑為4mm，每處理重復4次，28℃培養(yǎng)3~5d，觀察抑菌圈的產(chǎn)生情況，并對有抑制作用的細菌測量抑菌帶的寬度、病原菌的菌落直徑，計算拮抗菌的抑制率。抑菌作用的大小以抑菌帶和抑制率表示[7]。

抑菌帶是指在對峙生長中生防菌和靶標病原真菌之間形成的一種透明帶。

抑菌率（%）＝[（對照的病原菌落半徑-對峙培養(yǎng)中病原菌菌落半徑）/對照的病原菌落半徑]×100

拮抗細菌的鑒定通過革蘭氏染色以及菌體的形態(tài)進行，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為陽性菌，大腸桿菌（Escherichia coli）為陰性菌，具體參考沈萍等[8]運用的方法。

2結(jié)果與分析

2.1嶗山茶園病害種類調(diào)查結(jié)果

2006~2007年對不同田塊茶園分別進行茶樹病害的系統(tǒng)調(diào)查，結(jié)果見表1。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有9種病害在嶗山地區(qū)發(fā)生，其中茶云紋葉枯病為嶗山茶園的主要病害，茶炭疽病、茶赤葉斑病為次要病害。葉部病害發(fā)生普遍，根部發(fā)生較少。

2.2茶云紋葉枯病的分離與鑒定

從茶云紋葉枯病的病葉上分離獲得的分離物，通過在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和孢子以確定茶云紋葉枯病菌，采用孢子懸浮液回接到茶樹葉片上，保濕48h，10~15d后，對發(fā)病的葉片再一次進行病菌的分離。通過分離純化以及致病性測定確定分離物即為茶樹云紋葉枯病菌。

茶云紋葉枯病主要危害葉片，以成葉為主，病斑初為黃色水浸狀，后期顏色加深，有波浪形波紋，病斑中央為灰白色，上生小黑點，沿輪紋排列，病斑多在葉尖或葉緣發(fā)生。病斑上的小黑點為分生孢子盤，分生孢子為單胞。

2.3拮抗細菌的篩選與鑒定

從茶樹根際土壤和莖葉等健康組織中分離得到細菌131株。以茶云紋葉枯病菌為靶標菌一共篩選出了5種抑制率大于50%的拮抗細菌，編號分別是L1、L2、L3、La和Lb。其中，以La的抑制效果最佳，抑菌帶寬度和抑菌率分別達到0.72cm和77.3%。其他4株拮抗菌對茶云紋葉枯病菌也有一定的效果，其抑制率分別為71.2%、54.8%、52.0%和65.5%（見表2）。

對5株拮抗菌進行了培養(yǎng)性狀和形態(tài)鑒定，La、Lb、L1、L3等4個菌株的菌落是凸起的，而L2的菌落是平展的；在5株拮抗菌中僅有Lb產(chǎn)生紅色色素，其余4個菌株不產(chǎn)生色素。5株拮抗菌細胞均為長桿狀且產(chǎn)生芽孢，通過革蘭氏染色均為是革蘭氏陽性菌（G+）。初步鑒定認為，這5株拮抗菌為芽孢桿菌（Bacillus spp.）。

3結(jié)論與討論

茶樹病害在我國各地均有不同程度地發(fā)生和危害，對茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)有一定影響。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界已有記載的茶樹病害達380多種，常見的約有30多種。通過對嶗山茶場的茶樹病害的系統(tǒng)調(diào)查，摸清了嶗山茶場的主要病害為茶樹云紋葉枯病，同時茶炭疽病和茶赤葉斑病也有一定程度發(fā)生。茶樹葉部病害發(fā)生較為普遍，根部和枝部病害發(fā)生較少，這和馮明祥等[8]的報道一致。在調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種對不同病害抗性不同，可以種植抗性品種進行病害的防治。這些結(jié)論為進一步制定嶗山茶園病害的綜合防治措施提供了依據(jù)。

茶葉無公害生產(chǎn)，關(guān)鍵性技術(shù)是要解決好病蟲害防治與農(nóng)藥殘留的矛盾，以期獲得優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)的茶葉。綠色農(nóng)藥的研究與開發(fā)是解決農(nóng)藥殘留問題的根本措施之一，所以研究和利用拮抗菌來防治茶樹病害有著良好的應用前景[9]。本研究從茶樹的根際和葉圍分離獲得了5株芽孢桿菌，對茶樹云紋葉枯病菌具有較好的抑制作用，具有作為生防菌的潛能。這些菌株的作用機理、活性物質(zhì)等還有待進一步研究。

4參考文獻

[1] 陳宗懋.解讀世界各國制訂的茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）標準及其應對措施[J].中國植保導刊，2007，27（9）：30-33.

[2] 汪東風，杜德紅，江曉紅，等.嶗山綠茶微生物污染情況及控制關(guān)鍵技術(shù)[J].茶葉，2004，30（1）：40-42.

[3] 胡維軍，侯君合，劉學才，等.嶗山綠茶不同產(chǎn)區(qū)茶園土壤與灌溉水安全質(zhì)量分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2007（2）：83-85.

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[5] 陳宗懋，陳雪芬.茶樹病害的診斷和防治[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1990.

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[8] 沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗（第3版）[M].北京：高等教育出版社，1996.

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[10] 盧東升，吳小芹.茶園有益微生物及其微生態(tài)效應研究進展[J].信陽師范學院學報（自然科學版），2005，18（1）：117-121.