放線菌Ｃ３－１１的抗菌活性篩選及發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

張玲玲　董美玉　許鳳春　汪江峰　黃　劍

摘要從重慶酉陽山區(qū)土樣中分離到1株放線菌C3-11，該菌株發(fā)酵液對14種病原真菌進行室內(nèi)生物活性篩選，結(jié)果表明，C3-11菌株發(fā)酵液對油菜菌核病菌和黃瓜灰霉病菌的菌絲抑制率都在90%以上，對其余供試病原菌均有不同的抑制作用。通過對發(fā)酵液穩(wěn)定性的初步研究，表明該菌株的發(fā)酵液對光照、溫度及酸性條件作用下都較為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞放線菌C3-11；抗菌活性；穩(wěn)定性

中圖分類號Q939.96文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2009）03-0109-02

從微生物代謝產(chǎn)物中尋找控制有害生物的生物農(nóng)藥是新農(nóng)藥研究的一個重要方向[1]，放線菌是重要的微生物資源，是產(chǎn)生抗生素的主要來源。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000種生物活性物質(zhì)中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的[2-5]，世界各國對放線菌的研究與資源開發(fā)極為重視，其中農(nóng)用抗生素的篩選和應(yīng)用已成為研究的重點。因此，從放線菌中尋找農(nóng)用抗活性物質(zhì)有較為廣闊的前景。本研究是從我國不同地域采集的土樣中，進行廣泛地篩選分離，從重慶酉陽山區(qū)的土樣中分離到1株放線菌C3-11，該菌株對油菜菌核病菌有強烈的抑制作用，同時對其他病菌也有一定的抑制作用，在確定其生物活性后，又對其發(fā)酵液的穩(wěn)定性做了進一步的研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土樣。試驗所用土樣采自于重慶、河南、云南和貴州等地。

1.1.2供試病原菌。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉病菌（Gibberella zeae）、蘋果腐爛病菌（Cytospora mandshurica）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、半夏立枯病原菌（Rhizoctonia solani）、水稻紋枯病原菌（Thanatephorus cucumeris）、煙灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、交鏈孢病菌（Al-ternaria alternata）、萵苣黑斑病菌（Stemphylium chisha）、甘薯黒疤病菌（Ceratocystis fimbriata）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtills）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.1.3培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；高氏1號合成培養(yǎng)基（可溶性淀粉20g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01g，瓊脂20.0g，水1 000mL，pH值7.6~7.8）；液體發(fā)酵培養(yǎng)液（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，蛋白胨3.0g，NaCl 2.5g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4。用250mL三角瓶分裝，每瓶100mL，121°C滅菌30 min。）；種子發(fā)酵培養(yǎng)基（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，淀粉20.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4）。

1.2方法

1.2.1菌種的篩選。將土樣自然風(fēng)干，用研缽磨細，過孔徑0.1mm篩，稱取研細的土壤5g，加入盛有45mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩，制成10-1土壤濃度懸浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0mL上清液，移入盛有9mL滅菌水的10mL容量瓶中，制成10-2土壤濃度懸浮液。依此類推，制成10-3、10-4和10-5土壤濃度懸浮液，吸取上述10-3～10-5土壤濃度懸浮液0.1mL（約2滴），加到高氏1號合成瓊脂培養(yǎng)基平板上（加50mg/L重鉻酸鉀作為抑制劑）進行菌種分離，用滅菌涂布棒涂均。28℃培養(yǎng)，純化后轉(zhuǎn)接到斜面保存。

1.2.2發(fā)酵液的制備。將保存的菌種劃線接種于高氏1號平面培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6d。將培養(yǎng)好的菌落接入種子發(fā)酵培養(yǎng)基中置于恒溫?fù)u床上發(fā)酵2d，將種子發(fā)酵液以10%的接種量接種于小米液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵6d后過濾，發(fā)酵液4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3抑菌試驗。

（1）菌絲生長速率法[6]。將原始菌株發(fā)酵液10mL與90mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基凝固后，在每個培養(yǎng)基平板上放入1個供試病原真菌菌餅（直徑為4mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，每處理重復(fù)3次。置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)72～96h后，用“十”字交叉法測量供試病原真菌菌落生長直徑，用下式計算抑制率。

（2）管碟法[6]。將供試菌與適量培養(yǎng)基充分混勻，倒入9cm培養(yǎng)皿中制成帶菌平板，每個平板上放上3個牛津杯（內(nèi)徑0.6cm、外徑0.8cm、高1cm的不銹鋼杯），每管加入發(fā)酵原液0.2mL，以蒸餾水為對照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h后，采用“十”字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.4發(fā)酵液的穩(wěn)定性試驗[8-9]。

（1）光照條件下的穩(wěn)定性試驗。將C3-11的發(fā)酵液置于室溫光照放置5d、10d、20d、30d、40d、50d、60d，另外取原始發(fā)酵液10mL于滅菌過的離心管中，紫外線照射1h。以油菜菌核病菌為指示菌，用菌絲生長速率法測定抑菌活性。根據(jù)抑制率的大小來確定其穩(wěn)定性。

（2）溫度條件下的穩(wěn)定性試驗。將發(fā)酵液于40℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃分別處理1h，以及高溫滅菌40min，以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照，以油菜菌核病菌為指示菌，用菌絲生長速率法測定抑菌活性，每處理重復(fù)3次。

（3）酸、堿的穩(wěn)定性試驗。將菌株發(fā)酵液用1moL/L HCl和1moL/L NaOH分別將pH值調(diào)到2、4、6、8、10、12，放置一段時間后再將各發(fā)酵液的pH值調(diào)回到原始發(fā)酵液的pH值7，以油菜菌核病菌為指示菌，用菌絲生長速率法測其抑菌活性的變化，以原始發(fā)酵液pH值為7做對照，每處理重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1抗菌活性菌種的篩選

對篩得的200株放線菌做抑制真菌活性試驗，計算抑菌率。發(fā)現(xiàn)了幾株抑菌活性較高的放線菌菌株，其中從重慶酉陽山區(qū)土樣中挑出1株有明顯抑制油菜菌核病菌活性的菌株，命名為C3-11。做搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，進一步做抑菌試驗復(fù)篩。

2.2發(fā)酵液抑菌生物活性作用結(jié)果

從表1可以看出，C3-11菌株發(fā)酵液對油菜菌核病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率都在90%以上，對玉米小斑病菌抑制率在85%以上，對其余供試病原菌均有不同的抑制作用。從表2可以看出，C3-11菌株發(fā)酵液對這3種病原細菌的抑菌圈不明顯，抑菌圈直徑較小，表明此菌種發(fā)酵液對這幾種病原細菌的抑制效果不明顯，但對病原真菌抑制效果明顯，尤其對油菜菌核病菌的抑菌效果最好，達到97.8%。

2.3發(fā)酵液對光的穩(wěn)定性

從圖1可以看出，C3-11菌株發(fā)酵液在室溫下放置5d、10d、20d、30d、40d、50d、60d抑菌活性變化不大，放置60d后抑菌活性僅下降了4.7%，但在紫外線下照射1h后抑菌活性下降了11.5%，抗菌活性略有下降。說明C3-11菌株發(fā)酵液在室溫條件下是穩(wěn)定的，不發(fā)生分解及結(jié)構(gòu)上的改變，紫外線照射下活性下降不大，相對穩(wěn)定。

2.4發(fā)酵液對溫度的穩(wěn)定性

由圖2可以看出，發(fā)酵液在80℃處理的與對照相比變化不大，溫度大于90℃時，抗菌活性才下降，大于100℃抗菌活性下降較快，高溫滅菌40min后抗菌活性只有49.6%，說明C3-11菌株發(fā)酵液在當(dāng)溫度高于100℃抗菌活性則有較為明顯的下降。但當(dāng)溫度低于80℃時則具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.5發(fā)酵液對pH值的穩(wěn)定性

從圖3可以看出，C3-11菌株發(fā)酵液在pH值為4時抗菌活性為91.3%，與原始發(fā)酵液相比下降不大，當(dāng)pH值為2時，抗菌活性為80.7%，比原始發(fā)酵液下降了14.7%，說明C3-11菌株發(fā)酵液在弱酸條件下比較穩(wěn)定，堿性條件處理后活性下降較大，當(dāng)pH值為12時抗菌活性60.8%，與原始發(fā)酵液相比下降較多。因此，C3-11菌株發(fā)酵液的分離純化和使用過程中應(yīng)保持在中性或弱酸性環(huán)境中為佳。

3結(jié)論與討論

研究表明，從土壤中篩選得到的放線菌C3-11對幾種真菌病原菌都有較好的抑制作用，尤其是對油菜菌核病菌的抑制作用最強，達到97.8%，但對病原細菌的抑制作用不明顯。因此，C3-11可望作為候選菌株以進一步研究其抗菌活性物質(zhì)。本試驗還進一步對C3-11菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果表明發(fā)酵液對光、溫度及酸都有良好的穩(wěn)定性，對堿的穩(wěn)定性稍差一些。這為菌株發(fā)酵液活性成分的分離純化提供了參考。關(guān)于該放線菌菌株的鑒定、發(fā)酵

條件優(yōu)化及活性成分的分離正在進一步地研究中。

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