基因打靶技術(shù)及其應用前景

喬德瑞 朱芷葳

摘要: 基因打靶技術(shù)是一項新興的分子生學技術(shù),綜述了基因打靶技術(shù)的原理、操作以及應用與研究進展。

關(guān)鍵詞:基因打靶;同源重組;打靶載體;打靶效率;篩選系統(tǒng)

中圖分類號:Q78文獻標識碼:A文章編號: 1007-5739(2009)20-0368-02

基因打靶是20世紀80年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學技術(shù),是利用基因轉(zhuǎn)移的方法,將外源DNA序列導入靶細胞后,通過外源DNA序列與靶細胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組,將外源DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定位點,或?qū)δ骋活A先確定的靶位點進行定點突變,從而改變細胞遺傳特性的方法[1]。作為一項新興的技術(shù),基因打靶有著其無可比擬的優(yōu)點:基因打靶所適應的細胞既可以是原核細胞,也可以是真核細胞;基因打靶能把外源基因引入染色體DNA的特定片段上;在設計合理的情況下,基因打靶可對宿主細胞染色體基因進行精細的改造;基因打靶后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA的復制而穩(wěn)定復制[2]。目前,基因打靶技術(shù)已應用在改造生物,培育新的生物品種,研究基因結(jié)構(gòu)與功能、表達與調(diào)控,研究細胞生活周期調(diào)控機制,遺傳病的基因治療等方面。盡管還存在著一些技術(shù)問題,但隨著研究的深入,基因打靶技術(shù)正在不斷發(fā)展與完善。

1基因打靶技術(shù)的原理

進行基因打靶,首先要設計和合成一個靶載體。該載體不僅含有需要插入的DNA序列,其兩端還含有與靶基因座上的序列相同的核苷酸片段,即同源重組指導序列[3]。將此載體用基因轉(zhuǎn)移的方法導入靶細胞。通過外源載體和內(nèi)源靶位點相同的核苷酸序列之間的同源重組,使外源DNA定點整合到靶細胞特定的基因座上。同源重組的分子機制目前尚未闡明,但已相繼提出了多種解釋同源重組的模型,其中Meselson—Radding 模型不僅可以解釋交互重組的現(xiàn)象,而且還可以圓滿地解釋基因轉(zhuǎn)變現(xiàn)象,因此被廣泛接受[4-6]。但Szostak 等提出的雙鏈斷裂修復模型(DSBR)能更好的解釋雙鏈斷裂可以大大提高同源重組的效率這一現(xiàn)象[7]。

2基因打靶的操作

2.1基因打靶載體的構(gòu)建

基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標記基因等非同源序列,其中同源序列是同源重組效率的關(guān)鍵因素,基因打靶載體的同源重組序列一般可通過特異性探針從基因組DNA文庫中分離得到,也可以利用PCR對基因組目標的DNA序列進行擴增得到[8]。

基因同源重組的發(fā)生依賴于同源序列的長度,目前認為30～40 bp的同源序列長度將是同源重組發(fā)生的保險線。實驗表明,在哺乳動物細胞內(nèi),當同源序列長度在295～1 800bp之間時,重組率與同源序列長度呈正比,當同源序列長度在200bp以下時,重組效率明顯降低。這對選擇合適的同源重組指導序列長度具有重要的指導意義[9]。一般情況下,同源重組指導序列為基因組DNA而不用cDNA,以免造成基因組缺失或形態(tài)改變。

基因打靶載體有基因插入型載體和基因置換型載體2種類型。插入型載體與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點,線性化后,同源重組導致基因組序列的重復,從而干擾目標基因的功能。置換型載體進行線性化的酶切位點在引導序列和篩選基因的外側(cè),線性化后,同源重組使染色體DNA序列被靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采取置換型載體進行基因打靶。

外源DNA導入的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等[10]。目前應用最廣泛的是顯微注射法。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力,可用于時空特異性的基因打靶,在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.2受體細胞轉(zhuǎn)化

由于在同源序列附近的DNA有雙鏈斷裂能促進同源重組,因此在完成打靶載體的構(gòu)建后,以限制性酶線性化載體并已去除質(zhì)粒部分,用電穿孔、顯微注射、DNA—磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體包裝和PEG介導等方法把上述重組DNA片段轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)[11]。

2.3篩選

基因打靶的篩選系統(tǒng)多種多樣,現(xiàn)今采用的一般有:①選擇標記基因定點突變的篩選;②正向選擇法;③無啟動子篩選法;④正負篩選法。這里主要介紹正負篩選法[12]。

用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞,篩選通常使用正、負選擇法。構(gòu)建載體時,在靶基因的同源序列中插入正選擇標記,在同源序列之外的γ末端,甚至γ和ζ 2個末端接上負選擇標記。轉(zhuǎn)化受體細胞的過程中如果所導入的重組DNA與受體細胞基因組DNA發(fā)生非同源重組,則外源基因通常是從頭至尾均整合進入受體細胞基因組中,此時正、負篩選標記基因同時表達,若為同源重組,外源目的基因及正選擇標記會整合到受體細胞基因組同源序列的基因座上,而位于同源序列外端的負選擇標記基因則在重組后丟失[13,14]。因此時僅有正篩選標記基因表達。例如,實驗室常以新霉素抗性記憶(neo)為正標記基因,以單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)作為負篩選基因,以藥物G418和GANC(丙氧鳥苷)作雙重選擇,其中neor基因的產(chǎn)物使細胞具有G418抗性,而HSV-tk基因的產(chǎn)物則使丙氧鳥苷變成毒性核苷酸,從而致死[15]。用G418篩選所有能表達neor基因的細胞,然后用GANC淘汰所有HSV-tk正常表達的細胞,剩下的細胞即為命中的細胞。

2.4鑒定

觀察被擊中細胞的生物學特性,并進行分子生物學檢測?？梢杂锰禺怭CR的方法鑒定,即:PCR引物一端以基因組DNA的特定基因座為模板,另一端以導入的外源基因為模板,這樣保證擴增后的片段為同源重組產(chǎn)生的特殊片段。對經(jīng)PCR鑒定的克隆用Southern雜交產(chǎn)生特殊帶譜的方法來進一步確定同源重組克隆[16]。

3基因打靶技術(shù)的應用與研究前景

3.1基因功能和基礎理論研究方面

首先,基因打靶通過定點改造基因組中的特定基因,有可能在細胞水平上研究特定基因的功能和調(diào)控機制。從定點突變的干細胞獲得突變基因型個體,為在生物體整體水平了解基因的胚胎發(fā)育和生理功能提供了可能。

3.2分子免疫方面

可用基因打靶觀察某一基因?qū)γ庖呒毎l(fā)生發(fā)展的影響。例如,Manjunath等(1993)用基因打靶技術(shù)破壞了CD43基因,結(jié)果提高了T淋巴細胞的粘附性,為進一步觀察和探討一些免疫機制奠定了基礎。

3.3病理模型方面

自Garrd發(fā)現(xiàn)Alkaptonuria遺傳病以來,研究者們發(fā)現(xiàn),許多遺傳病都是由單個基因突變引起的。用基因打靶技術(shù)對小鼠或其他哺乳類動物中此類單基因進行定點突變,就可為人類該基因缺陷或突變所致的遺傳病建立精確的動物模型,為了解這些遺傳病的病理生理生化特性及尋找適當?shù)乃幬锖椭委熓侄蔚於ɑA。到目前為止,已得到Lesch-Nyh-ansyndrome、Cysticfibrosis和Gaucheris等多種病理模型。例如,構(gòu)建定點突變的小鼠凝血因子IX胚胎干細胞(ES)基因打靶載體,在小鼠IX因子基因第8外顯子中分別引入3個突變,構(gòu)建置換型打靶載體轉(zhuǎn)染ES細胞,經(jīng)藥物篩選后,挑取抗性細胞,這種體外定點突變系統(tǒng)可對大基因進行精細地修飾,為建立更精確的模擬人類疾病的動物模型奠定基礎。

3.4基因治療方面

據(jù)統(tǒng)計,到1998年為止,正在進行的臨床基因治療方案有278項。但是,近年來的研究表明,外源基因的導入有可能導致一些與預想目的相悖的結(jié)果,如使正?；蚴Щ罨蚣せ钤┗虻取Ｒ虼?要利用基因打靶技術(shù)用于疾病治療,造福人類,還需要不懈的理論研究和實踐檢驗[17]。

3.5轉(zhuǎn)基因動植物和生物反應器方面

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將體外重組的結(jié)構(gòu)基因?qū)雱又参矬w內(nèi),使外源基因與動植物本身的基因整合在一起,實現(xiàn)體內(nèi)表達,從而培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因動植物的技術(shù)。其特點是可以使動植物增加某一功能或某一產(chǎn)物,但是,由于轉(zhuǎn)基因在動植物細胞基因組中的整合是隨機性的,因此,它的發(fā)展和應用受到了一定的限制。如果應用基因打靶技術(shù)把外源基因準確地插入受體細胞的基因組中,定點改造原有基因的功能,可使轉(zhuǎn)基因動植物和生物反應器的研制更為精確。

基因打靶技術(shù)是近10余年發(fā)展起來的分子生物學技術(shù),它克服了隨機整合的盲目性和偶然性,是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展和人類基因組圖譜的完成、功能基因組學研究正大規(guī)模啟動,基因打靶已經(jīng)成為后基因組時代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。因此,通過基因打靶將外源基因在ES細胞或體細胞中進行定點整合并高效表達、利用顯微注射和核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物等具有廣闊的發(fā)展前景。

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