水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

高 林 陸 怡 史賢明

摘要:介紹了水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測分析方法的研究進(jìn)展,并闡述了各檢測方法的特點及檢出限,以期為水產(chǎn)品氯霉素殘留檢測提供參考。

關(guān)鍵詞:氯霉素;檢測;水產(chǎn)品

中圖分類號:O69文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號: 1007-5739(2009)20-0340-02

氯霉素(chloramphenicol,CAP)于1947年從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuela)的培養(yǎng)濾液中分離出的結(jié)晶性抗菌素,是第一個采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的抗生素,它是一種有效的廣譜抗生素,對多種病原菌有較強的抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中,也常用氯霉素治療各種傳染性疾病。但研究表明,氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用,能抑制人體骨髓造血功能,引起人類的再生障礙性貧血,粒狀白細(xì)胞缺乏癥,新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病,低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性,因此氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視,歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零允許量”。我國是一個水產(chǎn)養(yǎng)殖大國,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,但養(yǎng)殖過程中濫用抗生素,已成為一個嚴(yán)重的水產(chǎn)品安全問題[1]。

氯霉素殘留檢測方法的建立始于20世紀(jì)70年代,隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn),氯霉素的檢測方法有很多種,大致可分為3類,即微生物法、化學(xué)分析法、免疫學(xué)檢測法。

1微生物法

微生物檢測氯霉素法可大體分為2種:一種是基于抗生素對微生物生長的抑制作用,主要有棉簽法、杯碟法、紙片法、TTC法、戴爾沃檢測、BY法等;另一種是由于微生物對氯霉素敏感而引起生化特性的變化,如氯霉素對鰒發(fā)光桿菌的抑光作用,通過檢測發(fā)光強度的變化來檢測氯霉素的含量。

(1)棉簽法。棉簽法是檢測動物體中抗生素殘留的現(xiàn)場試驗方法。該方法是用棉簽(拭子)采取動物體內(nèi)的組織液,然后將其放置于涂滿枯草桿菌的培養(yǎng)基中保溫過夜。根據(jù)棉簽周圍的抑菌圈有無以及大小來判斷抗生素殘留。梅先之等(1997)曾用該法檢測鯉魚中的CAP殘留含量,該方法的檢測限是1mg/kg,但容易造成漏檢。

(2)杯碟法。樣品經(jīng)處理后,注入牛津杯中,與含菌液的鑒定平板貼合,培養(yǎng)后,根據(jù)抑菌圈有無及大小判定結(jié)果。采用不同的試驗菌種,可檢測不同的抗生素[2]。該方法靈敏度比棉簽法高,能排除一定的干擾,但要進(jìn)一步提高靈敏度很困難。

(3)TTC法。在樣品中加入嗜熱鏈球菌經(jīng)培育2.5～3.0h后,加入4% TTC指示劑(三苯基四氮唑)水浴培養(yǎng)30min,顏色不發(fā)生變化為陽性;如果樣品呈紅色則為陰性。該法費用低,操作簡單;缺點易出現(xiàn)假陽性。

(4)戴爾沃檢測法。原理是利用微生物-嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養(yǎng)2.5～3.0h后會產(chǎn)酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變?yōu)辄S色;若樣品中不含抗生素,培養(yǎng)后樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素,嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產(chǎn)酸,指示劑將不變色。該法具有操作方便、容易判斷、結(jié)果可靠、費用適中等優(yōu)點;但也易出現(xiàn)假陽性。

(5)發(fā)光細(xì)菌法。王亞群等[3]建立了一種發(fā)光細(xì)菌檢測氯霉素殘留的新方法。在鰒發(fā)光桿菌培養(yǎng)液中添加不同濃度的氯霉素溶液,通過控制菌體起始發(fā)光強度,菌液與氯霉素作用時間,菌液與氯霉素體積比等建立發(fā)光細(xì)菌檢測水產(chǎn)品中氯霉素體系。該體系對氯霉素的檢測靈敏度可以達(dá)到0.1ng/mL,該法成本較低、操作快速簡單、檢測限低。作為水產(chǎn)品中痕量氯霉素殘留的一種快速、靈敏的檢測方法。

2免疫分析法

免疫分析法是以抗原與抗體特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的一類常用分析方法。由于氯霉素是半抗原,不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,將氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯結(jié)構(gòu)和大分子蛋白結(jié)合后均可作為完全抗原有效制備相應(yīng)的抗體,在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)免疫競爭法測定氯霉素含量,常用的有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、固體免疫傳感器、化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)等。

(1)酶聯(lián)免疫法(ELISA)。ELISA法簡單、快速、靈敏度高、重復(fù)性較好,適用于大規(guī)模CAP的殘留篩選檢測,目前市場上有多種氯霉素檢測試劑盒供應(yīng)。陳雪昌等[2]報道了采用德國R-Biopharm 公司生產(chǎn)的RIDASCREEN 氯霉素試劑盒檢測蝦肉中的氯霉素殘留方法,該法平均檢測下限為0.012 5μg/kg,回收率為88.1%～94.4%,RSD為2.98%～6.67%。美國IDS公司2009年3月新上市了一步法快速氯霉素ELISA試劑盒,是目前市面上操作時間最短的產(chǎn)品,檢測時間為20 min。但是ELISA的缺點在于影響因素較多,易出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果。

(2)化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)。CLEIA法是一種采用化學(xué)發(fā)光劑做為酶反應(yīng)底物的酶標(biāo)記免疫測定的方法。胥傳來等[4]建立了化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測方法(CLEIA)檢測對蝦組織中CAP的殘留,檢測靈敏度可達(dá)到0.01μg/L。高彬文(2007)利用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測魚蝦中氯霉素殘留,檢測限為5.8×10-4 μg/kg。該法靈敏度高、分析速度快、儀器簡單、不需復(fù)雜的樣品前處理過程等優(yōu)點,但ECLIA法對實驗條件的要求較高,其穩(wěn)定性及敏感性尚待進(jìn)一步提高。

(3)免疫膠體金法。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù),應(yīng)用該技術(shù)制成的膠體金試紙條具有簡便、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點,但其穩(wěn)定性及靈敏度尚待進(jìn)一步提高,且不宜定量。李余動(2005)建立了膠體金免疫層析試紙條法快速檢測蝦肉等組織試樣的氯霉素殘留,靈敏度最低值可達(dá)到1ng/mL,只需5～10min。

(4)放射免疫法(RIA)。Arnold和Somogyl[5]建立了放射免疫分析檢測方法,該方法靈敏度高,最低檢測限為200 ng/kg,但該法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需要復(fù)雜儀器設(shè)備等缺點,應(yīng)用范圍受到限制。

(5) CHARM Ⅱ。CHARM Ⅱ檢測氯霉素殘留試劑盒為美國FDA推薦使用的檢測儀器,由美CHARM Science公司研制生產(chǎn)的第2代產(chǎn)品。該法靈敏度高,對于魚組織中氯霉素殘留量的檢出限可達(dá)0.15μg/kg,但同樣存在假陽性結(jié)果的問題

(6)伏安免疫法。宋巍巍[6]建立了以間接競爭ELISA為基礎(chǔ)、ALP為標(biāo)記酶、pNPP底物、伏安法為檢測法的伏安免疫分析體系,該方法檢測CAP的檢出限為0.064μg/L,檢測線性范圍為0.15～600μg/L,與傳統(tǒng)的ELISA法相比,此法靈敏度高,特異性強,操作簡單。

3色譜技術(shù)

色譜方法可檢出樣品中的痕量污染物,具有檢測限低、精確度高等特點,是水產(chǎn)品中CAP殘留檢測最有效的一類方法,但缺點是操作復(fù)雜、時間長、成本較高。

(1)高效液相色譜法(HPLC)。HPLC法檢測氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法,此法不需衍生化步驟、樣品處理程序較為簡單、重復(fù)性好、假陽性少,但檢出限較高,為5～10μg/kg,回收率偏低,處理過程復(fù)雜、分析速度慢等缺點。Keuken等(1986)報道了用高效液相色譜法篩選和確證在可食用的動物組織中的氯霉素殘留,檢出限為5μg/kg[7]。

(2)氣相色譜法(GC)。利用GC檢測氯霉素的優(yōu)點是高分離效能、檢出限低、靈敏度高,但需要衍生化,過程繁瑣,易出現(xiàn)假陽性。吳明亮[8]報道了蘇北出口水產(chǎn)品中氯霉素殘留測定的氣相色譜法。該方法測定值可達(dá)0.1μg/kg以下,該法重復(fù)性好,假陽性少。

(3)聯(lián)用技術(shù)。聯(lián)用技術(shù)可揚長避短,一般兼分離、定量和定性(分子結(jié)構(gòu)信息)于一體,因而特別適用確證性分析。常見的聯(lián)用技術(shù)有TLC-MS、LC-MS、GC-MS、SFC-MS、CZE-MS、LC-NMR等。LC-MS是美國FDA推薦使用的氯霉素確證方法,其靈敏度較熒光檢測器高1個數(shù)量級,能方便地對ng/kg級的殘留組分進(jìn)行檢測與結(jié)構(gòu)確證。林海丹(2005)報道了水產(chǎn)品中氯霉素藥物殘留的LC-MS/MS分析方法,該法測定檢出限為0.1μg/kg,回收率為95%～110%。黃冬梅(2006)報道了利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量,當(dāng)添加水平為0.5～10.0μg/kg時,回收率為74.8～84.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.90～8.99%。

4其他分析方法

目前還有很多其他分析方法運用在氯霉素殘留的檢測上。SFC可彌補GC和HPLC的不足,可以方便連接,但不可能替代GC和HPLC,SFC最大的優(yōu)點是可以方便地連接各種靈敏的檢測器。

毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)兼有高壓電泳的高速、高分辨率和HPLC靈活、高效的優(yōu)點,可簡化樣品前處理、多殘留分析自動化,CZE的主要問題是樣品量太少,限制了檢測的靈敏度。伏安法相對誤差較小,速度快,但汞易揮發(fā)且有毒,靈敏度低。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)突變體檢測氯霉素,該法的優(yōu)點為成本低,操作簡便、快捷[9]。分子印跡技術(shù)的發(fā)展為CAP的前處理提供了新的技術(shù)。但目前還處于初步研究階段,有待更進(jìn)一步的研究。

總體說來,基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的免疫學(xué)測定方法靈敏度較高,特異性強,試樣預(yù)處理簡單,分析時間短,現(xiàn)在已出現(xiàn)一些試劑盒產(chǎn)品,使用方便,因此,有廣闊的應(yīng)用前景。色譜方法可檢出樣品中的痕量污染物,具有檢測限低、精確度高等特點,但是存在著操作復(fù)雜、時間長、成本較高的問題,尤其不適宜作為水產(chǎn)品生產(chǎn)流通過程中的現(xiàn)場監(jiān)測,也無法對污染物質(zhì)進(jìn)行生物危害性評估。同時一些新的生物學(xué)方法也不斷得以研究開發(fā),如發(fā)光細(xì)菌檢測氯霉素、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶突變體檢測等由于具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點也逐漸得到運用。

5參考文獻(xiàn)

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[3] 王亞群,王靜雪,林洪,等. 發(fā)光細(xì)菌法檢測水產(chǎn)品中氯霉素體系的建立[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,39(1):66-70.

[4] 胥傳來,彭池方,郝凱. 化學(xué)發(fā)光酶免疫法測定水產(chǎn)品中殘留氯霉素[J].分析化學(xué),2005,33(12):1809.

[5] ARNOLD D,SOMOGYI A. Trace analysis of chloramphenicol residues in eggs,milk,and meat comparison of gas-chromatography and radioimmunoassa[J].Journal of the association of official analytical chemists,1985,68(5):984-990.

[6] 宋巍巍,丁明星,張挪威,等. 伏安免疫法檢測牛奶中氯霉素殘留[J].分析化學(xué),2007,35(12):1731-1735.

[7] KEUKENS BEEK. High performance liquid chromatographic screening and con firmation methods for chloramphenicol residues in meat with off-line cartridge s ample clean-up and on-linediode array UV-VIS detection of Chromatogr,1986(352):445-453.

[8] 吳明亮.水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的檢測報告[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2007(6):88-90.

[9] 王藝穎. 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶突變體檢測氯霉素[D].上海:華東師范大學(xué),2005.