豬苓菌培養(yǎng)特性研究進(jìn)展

張長青 章松柏 魯紅學(xué)

摘要闡述了豬苓菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、適生條件、營養(yǎng)特性、培養(yǎng)基配方、適生樹種及豬苓菌與伴生菌、蜜環(huán)菌的相互關(guān)系和誘導(dǎo)豬苓菌絲扭結(jié)形成菌核的相關(guān)因子,以期為豬苓菌的深入研究和人工栽培提供參考。

關(guān)鍵詞豬苓菌;培養(yǎng)特性;伴生菌;蜜環(huán)菌;菌核形成

中圖分類號S646.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)20-0105-03

豬苓菌(Dendropolyporus umbellatus(Pers.)Jülich),別名豬苓花、豬靈芝,于實(shí)體叢生,肉質(zhì)鮮美,其地下的菌核即為豬苓,是傳統(tǒng)的真菌藥物之一,在我國已有2 000多年的藥用歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,豬苓具有消炎、利尿、滲濕、通淋、退腫、降壓、輕身耐老、抗癌、抗輻射等功能,臨床上可治尿路結(jié)石、黃疸、急性腎炎、暑熱水瀉、全身水腫、心源性水腫、腹瀉、尿急、尿頻、尿道痛、肝硬化、腹水、乙型肝炎。豬苓多糖制劑對肺癌、肝癌、食道癌、宮頸癌及白血病均有較好的臨床效果。隨著我國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展,以豬苓為原料的成品藥必將得到進(jìn)一步開發(fā),探索人工栽培的新途徑必然會倍受關(guān)注。該文就豬苓菌的培養(yǎng)特性進(jìn)行了闡述,以期為豬苓菌的深入研究及人工栽培提供有價(jià)值的參考。

1菌絲的培養(yǎng)特性

1.1菌落與菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)

豬苓菌的分離一般可采用子實(shí)體、菌核組織分離和孢子分離。PDA、CPDA或GYA(葡萄糖-酵母粉-瓊脂粉)可作為分離或母種培養(yǎng)基[1-3]。在PDA上,豬苓菌落呈圓形,菌絲白色,絮狀,氣生菌絲發(fā)達(dá)。在平板或斜面培養(yǎng)基上均具有較強(qiáng)的爬壁能力。豬苓菌色素的形成受培養(yǎng)基中添加的成分(如單雙糖、糖醇及酪氨酸)、溫度、pH值和光照等因素的影響。

豬苓菌絲細(xì)胞狹長,多分枝,細(xì)胞壁較薄,直徑在0.95～4.50μm[2,4]之間,生殖菌絲上鎖狀聯(lián)合突起結(jié)構(gòu)明顯,頂端有膨大。平行菌絲間常有長短不一的H型橫向菌絲融合橋,進(jìn)而形成菌絲網(wǎng)絡(luò)。眾多菌絲糾結(jié)或合并可形成直徑10.0μm以上的菌索或大小為14.0～16.0μm×12.0～15.0μm的擬菌核結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)過程中氣生菌絲可斷裂形成節(jié)孢子或頂端單生或2～3個(gè)并生,橢球形,大小為3.0～16.0 μm×2.5～6.5 μm的厚垣孢子。顯微觀察,在豬苓菌絲間散布有形狀規(guī)則、晶形完整的八面體或雙錐形草酸鈣結(jié)晶。用高碘酸-Schiff試劑染色老化菌絲,在老化菌絲胞壁上或老化菌絲斷裂處富積有大量能被染成淡紅色、圓粒狀的次生代謝多糖結(jié)晶[5]。

1.2溫度、光照和pH值對豬苓菌生長的影響

豬苓菌絲在5～35℃[6-8]范圍內(nèi)均可生長,當(dāng)溫度低于15～18℃時(shí),菌絲生長速度減慢,長勢一般,菌絲褐變緩慢或暫無褐變。當(dāng)溫度高于28～30℃時(shí),菌絲生長速度也出現(xiàn)減慢,長勢變差,并易出現(xiàn)老化變褐[9,10]。在5℃以下或35℃以上,菌絲生長幾乎停滯。豬苓菌絲生長的適宜溫度為24±4℃,最適溫度為25℃[4,8]。

在黑暗和光照條件下,豬苓菌絲均可生長。但在全黑暗下菌絲生長快、長勢好;全光照或12h光暗交替,菌絲生長較慢,且易出現(xiàn)褐變老化[6,8]。

有試驗(yàn)表明,每天給豬苓菌絲2～3h的4℃低溫處理,有利于誘導(dǎo)其菌核的產(chǎn)生。一定溫差(10℃)的變溫處理和暗培養(yǎng),可誘導(dǎo)豬苓菌絲直接分化子實(shí)體原基[6,8]。

一般而言,多數(shù)真菌都適宜在偏酸性環(huán)境中生長[11]。豬苓菌絲可以在pH值為3.5～9.0的環(huán)境下生長[4,8],但以中性偏酸(pH值4.0～7.0)的條件比較適合,pH值低于4.0或高于8.0的菌絲生長慢、長勢差,易出現(xiàn)菌絲褐化[6-8,10]。

1.3菌絲生長的營養(yǎng)特性

1.3.1對碳源的利用。豬苓菌對碳源有較為寬泛的適應(yīng)性。葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、麥芽糖醇、低聚異麥芽糖、甘露糖、甘露醇、低聚甘露糖、木糖、木糖醇、低聚木糖、淀粉、糊精、甘油、山梨醇、乙醇、羧甲基纖維素等都可以作為豬苓菌絲生長的碳源。其中麥芽糖、甘油、山梨醇、麥芽糖醇、低聚異麥芽糖作碳源菌絲生長速度快,氣生菌絲發(fā)達(dá),菌絲叢疏;淀粉、乙醇、半乳糖、木糖、木糖醇、低聚木糖作碳源菌絲生長速度雖然較慢,但氣生菌絲極發(fā)達(dá),菌絲叢厚,尤其是木糖醇和木糖為碳源時(shí),氣生菌絲最發(fā)達(dá),菌絲叢最厚。葡萄糖、蔗糖、甘露糖、糊精、甘露醇、低聚甘露糖等作碳源菌絲生長速度較快,氣生菌絲發(fā)達(dá),但老化快;果糖作碳源菌絲生長速度較快,氣生菌絲易組織化呈肉皮狀[10,11];豬苓菌對羧甲基纖維素的利用率較低[12]。

1.3.2對氮源的利用。有機(jī)氮源(動物性、植物性和微生物性)比無機(jī)氮源更適合豬苓菌菌絲生長。在有機(jī)氮源中,豬苓菌絲生長速率和長勢依次為:酵母膏>黃豆粉>玉米糠>蛋白胨>麩皮粉[13];在無機(jī)氮源中,豬苓菌絲生長速率和長勢依次為:硝酸鈉>硫酸銨>尿素[10]。豬苓菌在含尿素的培養(yǎng)基上,雖然徑向生長緩慢,但尿素能在一定的使用濃度范圍內(nèi)隨濃度的升高較早地促使菌絲扭結(jié)形成幼小的白色擬核,并漸變成類似于豬苓菌核表面有油漆光澤的灰黑色擬核。菌絲擬核化的立體生長自然會影響菌落的平面徑向生長[14]。

碳氮比對豬苓菌絲生長速度有明顯的影響,但對菌絲長勢影響不明顯。豬苓菌絲在碳氮比10～100∶1的范圍內(nèi)均可生長,但適宜的碳氮比為40～70∶1之間,最佳碳氮比為50∶1[13]。

1.3.3無機(jī)鹽對豬苓菌生長的影響。無機(jī)鹽是豬苓菌生命活動中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì),它們不僅具有調(diào)節(jié)滲透壓、氫離子濃度、氧化還原點(diǎn)位的作用,還是菌體的結(jié)構(gòu)、酶或輔酶的組成成分,有維持酶活的功能。無機(jī)鹽的使用因培養(yǎng)菌種類、培養(yǎng)基質(zhì)類型及培養(yǎng)方式的不同,使用劑量、作用效果也會不同,需靈活掌握。如硝酸鈉(NaNO3)、檸檬酸三銨[(NH4)3C6H5O7]、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨[(NH4)2SO4],按0.1%的添加量分別加入GPC(葡萄糖蛋白胨玉米漿)培養(yǎng)基中,硝酸鈉對豬苓菌絲生長有明顯促生作用,磷酸氫二鉀和硫酸銨、硫酸鎂作用效果不明顯,檸檬酸三銨和硫酸鎂對豬苓菌絲生長不利[10]。磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、硫酸鉀(K2SO4)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)分別添加到相應(yīng)PDA培養(yǎng)基中,各無機(jī)鹽菌對豬苓菌絲生長有利,尤以P、Cu、Zn的促生作用更為明顯。各無機(jī)鹽的適宜添加量分別為:NaH2PO4 0.090g/L、K2SO4 2.000g/L、CuSO4·5H2O 0.012～0.024g/L、ZnSO4·7H2O 0.024～0.030 g/L[14]。

1.3.4其他添加物對豬苓菌生長的影響。在培養(yǎng)基中適量添加非生物物質(zhì)和生物類培養(yǎng)液,如活性白土、硅藻土、高嶺土、豬苓伴生菌水提取物、蜜環(huán)菌水提取物、假單胞桿菌(Pseudomonas alba Migula)發(fā)酵液、靈芝[Ganoderma lucidum(Legss.ex Fr.)Karst]發(fā)酵液及金針菇[Flammulina velutipes(Fr.)Sing] 發(fā)酵液等均有良好的促生作用[10,15]。

2培養(yǎng)基配方對豬苓菌絲生長的影響

不論野生豬苓,還是保存的豬苓菌株的菌絲生長對營養(yǎng)的需求都比較簡單,可以在多種復(fù)雜或簡單的半合成或合成培養(yǎng)基上生長。如PDA培養(yǎng)基、CPDA培養(yǎng)基、葡萄糖-硝酸鈉-硫酸銨、黃豆餅粉培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、蘋果培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、GMY(葡萄糖-麥芽膏-酵母膏)培養(yǎng)基、GPC(葡萄糖-蛋白胨-玉米漿)培養(yǎng)基、GPY(葡萄糖-蛋白胨-酵母膏)培養(yǎng)基、甘油-蛋白胨-玉米漿培養(yǎng)基、米糠(麥麩)培養(yǎng)基、麥粒培養(yǎng)基、木屑密環(huán)菌(或豬苓菌核或榛蘑)煮汁培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基或只有碳源和氮源的簡單培養(yǎng)基[1,9,10,12]。其中黃豆餅粉培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、蘋果培養(yǎng)基、CPDA培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基、GPC培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基比較適合菌絲生長,而PDA培養(yǎng)基、GMY培養(yǎng)基、麥粒培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、木屑密環(huán)菌、豬苓菌核或榛蘑煮汁等培養(yǎng)基次之[1],葡萄糖-硝酸鈉-硫酸銨、羧甲基纖維素培養(yǎng)基較差[1,10]。但豬苓菌在初始接種菌絲生長較差的培養(yǎng)基上,經(jīng)過1～2次轉(zhuǎn)接后可逐漸適應(yīng)培養(yǎng)基質(zhì),菌絲生長速度會有所提高[1]。

麥芽汁培養(yǎng)以及以甘油(2.5%～7.5%)、甘露醇(2.5%～15%)[16]為碳源的培養(yǎng)基,不僅容易誘導(dǎo)豬苓菌絲形成擬核,同時(shí),還利于菌絲體產(chǎn)生豬苓酮類生物活性物質(zhì)[10]。

豬苓菌絲的液體培養(yǎng)可分為靜態(tài)淺層培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)。適宜于靜態(tài)淺層培養(yǎng)的配方為:麥芽汁液體培養(yǎng)基[17]、葡萄糖+馬鈴薯煮汁+蜜環(huán)菌煮汁培養(yǎng)基(pH值5.0)、麥芽糖+蜜環(huán)菌煮汁+麥麩煮汁培養(yǎng)基(pH值5.0)[18]、鮮蘋果250g、蛋白胨5g、麥芽糖15g、磷酸二氫鉀0.75g、硫酸鎂0.75g、V■ 75mg培養(yǎng)基(pH值3.9)[19]。適宜于振蕩培養(yǎng)的配方為:玉米面液體培養(yǎng)基[18]、玉米粉30g、酵母膏30g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、CaCO3 1.0 g、V■ 0.lg培養(yǎng)基(pH值5.8)[20]。適宜于通氣培養(yǎng)的配方為:可溶性淀粉20g、豆餅粉提取液300mL、玉米漿20mL、硫胺素0.5g(pH值6.5)[17]。液體培養(yǎng)以進(jìn)入穩(wěn)定期(培養(yǎng)第13～18d)菌絲體多糖含量最高。

3豬苓菌在不同樹種段材上的生長

Choi Kyoung-dal等將豬苓菌絲體分別接種在經(jīng)過滅菌的16種樹木段材(直徑15cm,長30cm)上,置于塑料袋中,在20℃黑暗條件下,培養(yǎng)10周后觀察,結(jié)果豬苓菌絲能在16種樹的段材上生長。其中野茉莉(Styrax japonica)、柿樹(Diospyros kaki)、闊葉紅松(Pinus koraiensis)、朝鮮紫莖(Ste-wartia koreana)、日本榿木(Alnus japonica)、燈臺樹(Cornus con-troversa)、Populus alba×tomentiglandulosa、雞爪槭(Acer palmatum)、櫻花(Prunus serrulata)和刺槐(Robinia pseudo-acacia)上菌絲相對生長旺盛,菌絲濃密。在野茉莉、朝鮮紫莖、燈臺樹、Populus alba× tomentiglandulosa、雞爪槭上還可形成菌核[4]。

4豬苓菌與蜜環(huán)菌、伴生菌的關(guān)系

1955年川村清一在豬苓菌核上首次觀察到有蜜環(huán)菌索存在[21],21世紀(jì)初郭順星等從野生豬苓穴中分離到了一株豬苓菌伴生菌[22]。至此人們開始了豬苓菌與蜜環(huán)菌和伴生菌相互關(guān)系的探究[23]。

4.1豬苓菌、伴生菌單獨(dú)培養(yǎng)

盡管豬苓菌與伴生菌在同種或不同培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),二者菌落的外部形態(tài)差異較大。但二者的菌絲形態(tài)比較接近,且菌絲提取物在247nm處的化學(xué)指紋圖譜相似。對豬苓菌與伴生菌的5.8SrDNA及其兩側(cè)的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)序列分析表明,伴生菌的ITS序列全長628bp,而豬苓菌的ITS全長序列均為626bp,相似性達(dá)99.36%[24],可見伴生菌與豬苓在分子進(jìn)化上有著極高的親緣性,伴生菌是多孔菌屬中的一個(gè)種(polyporus sp.)。

4.2豬苓菌與蜜環(huán)菌共培養(yǎng)

豬苓菌與蜜環(huán)菌共培養(yǎng)時(shí),兩菌接觸面無拮抗線出現(xiàn),當(dāng)蜜環(huán)菌菌索侵入豬苓菌落時(shí)(約深入豬苓菌落0.5cm處),很快就遭到豬苓菌強(qiáng)烈的阻遏反應(yīng),形成封鎖菌索延伸的隔離腔,并反侵染于蜜環(huán)菌菌索的皮層細(xì)胞及侵染帶邊緣細(xì)胞,導(dǎo)致環(huán)菌菌索內(nèi)部中空化[25]。蜜環(huán)菌則以消化腔內(nèi)豬苓菌絲獲取營養(yǎng),當(dāng)隔離腔中豬苓菌絲被消化消耗殆盡時(shí),由于蜜環(huán)菌無法產(chǎn)生新生菌索而突破隔離腔,因此不能獲得新的營養(yǎng)補(bǔ)給而出現(xiàn)生活力減弱,最終在隔離腔中溶解反而成為豬苓菌的營養(yǎng)。隔離腔和反侵入機(jī)構(gòu)則成為豬苓菌從蜜環(huán)菌中獲取營養(yǎng)的通道,使豬苓菌核得以發(fā)育[26]。豬苓菌與蜜環(huán)菌的關(guān)系是一種寄生與反寄生的共生營養(yǎng)關(guān)系。

4.3豬苓菌與伴生菌共培養(yǎng)

豬苓菌在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)很少有菌絲束的分化。當(dāng)豬苓菌與伴生菌共培養(yǎng)時(shí),在兩菌充分接觸界面處先形成一個(gè)菌絲交融帶,繼后形成結(jié)構(gòu)致密、拱形隆起、紅褐色的拮抗線。拮抗線中央為一些不具生活力的死細(xì)胞,靠近拮抗線的豬苓菌絲細(xì)胞膨大而中空,細(xì)胞壁單側(cè)加厚。而靠近拮抗線的伴生菌菌絲細(xì)胞也中空,但細(xì)胞壁不增厚或略有增厚。拮抗線隆起的頂層細(xì)胞逐漸分化成表皮老化后脫落。隨著伴生菌色素的分泌,培養(yǎng)基逐步變褐,豬苓菌落表面菌絲分化產(chǎn)生大量菌絲束,從菌絲束交織的地方分化出菌核原基。伴生菌是豬苓菌絲分化形成菌核的重要生物調(diào)控因子[27-29]。

4.4蜜環(huán)菌與伴生菌共培養(yǎng)

蜜環(huán)菌與伴生菌共培養(yǎng)時(shí),伴生菌長勢遠(yuǎn)不如單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)健壯。在蜜環(huán)菌影響下,菌落直徑僅至1cm左右便停止生長,伴隨菌落顏色變暗、表面干燥,最終完全凋亡。蜜環(huán)菌能穿透整個(gè)伴生菌菌落,在伴生菌菌落下方產(chǎn)生大量細(xì)小分枝。蜜環(huán)菌與伴生菌的關(guān)系也是一種寄生與反寄生的共生營養(yǎng)關(guān)系。顯微結(jié)構(gòu)觀察提供了有力的佐證:侵入到伴生菌菌落內(nèi)的蜜環(huán)菌菌索成近中空狀,只殘存少量不具生活力的髓部菌絲。在蜜環(huán)菌的皮層上,也明顯存有伴生菌侵入蜜環(huán)菌皮層細(xì)胞的侵入點(diǎn),并使皮層細(xì)胞由外向內(nèi)瓦解[30]。盡管如此,由于伴生菌長勢較弱,競爭不過蜜環(huán)菌,最終逃脫不了凋亡的厄運(yùn)。但從另一個(gè)角度反映出伴生菌對蜜環(huán)菌有促使漆狀物分泌、保持蜜環(huán)菌生長旺盛并不斷產(chǎn)生新菌索和分枝的良好作用,比豬苓菌更適合蜜環(huán)菌寄生。

4.5豬苓菌、伴生菌和蜜環(huán)菌共培養(yǎng)

豬苓菌、伴生菌和蜜環(huán)菌三者共同培養(yǎng),豬苓對蜜環(huán)菌的防御能力有所下降,表現(xiàn)為蜜環(huán)菌侵入豬苓菌落更深入(侵入菌落1.5cm),豬苓菌絲也不能形成完整的防御區(qū)。豬苓菌與伴生菌之間只形成一個(gè)菌絲交融區(qū),不再形成拮抗線。由于豬苓菌的存在,使得伴生菌對蜜環(huán)菌的耐受力有所提高,即使蜜環(huán)菌產(chǎn)生的新分枝均向伴生菌一側(cè)生長,但伴生菌依然保持活力。豬苓菌和伴生菌均能在蜜環(huán)菌菌索皮層上形成侵入位點(diǎn)[30],建立寄生關(guān)系,獲得各自所需營養(yǎng)。

豬苓菌與伴生菌、蜜環(huán)菌構(gòu)成了一個(gè)既相互關(guān)聯(lián)又相互制約的營養(yǎng)循環(huán)體系。伴生菌是豬苓菌核形成關(guān)鍵所在,而蜜環(huán)菌與菌核形成的關(guān)系不大,只是在豬苓菌核形成后才侵染菌核,是豬苓菌核繼續(xù)生長發(fā)育的關(guān)鍵。野生狀態(tài)下,蜜環(huán)菌一般不侵入當(dāng)年新生白苓,只能侵染越冬后的灰苓和黑苓。

另外,有報(bào)道指出,以豬苓菌絲體接種在滅菌的木段上,在無伴生菌或蜜環(huán)菌的情況下依然可以形成菌核[4];陳德育等[8]用棉皮木屑混合培養(yǎng)基(pH值自然),在25℃下培養(yǎng),菌絲長至菌袋的1/3時(shí),置于室溫(20～22℃)、空氣相對濕度80%的條件下,3周后室內(nèi)自然光照處理下可形成菌核組織,完全黑暗處理能在袋口較快地形成菌核。劉瑛穎等[16]對用GPC培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的菌核進(jìn)行了分析,其形態(tài)學(xué)和化學(xué)指標(biāo)成分與野生菌核相似。可見,誘導(dǎo)豬苓菌核形成的因子較多,伴生菌也絕非是唯一的關(guān)鍵因子。因此,對豬苓菌核的形成機(jī)理仍需進(jìn)行深入系統(tǒng)的探究。

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