肺復(fù)康方對(duì)肺癌癌因性疲乏裸鼠骨骼肌的影響

許雙潔 ，杜肖琳，王云啟

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410006；2.湖南省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)/中西醫(yī)結(jié)合科，長(zhǎng)沙 410013）

肺癌作為常見的惡性腫瘤，因其高發(fā)病率成為全球的“噩夢(mèng)”［1］。在我國(guó)惡性腫瘤患者中，肺癌更是成為了頭號(hào)死亡原因［2］。癌因性疲乏（Cancer-related Fatigue，CRF）作為惡性腫瘤中常見的并發(fā)癥，成為近些年醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)［3］。董亞娜［4］等的臨床研究指出：肺癌中CRF發(fā)生率高達(dá)76.67%，CRF的發(fā)生嚴(yán)重影響了肺癌患者的生存質(zhì)量。最新的NCCN CRF指南（2018版）定義CRF為：一種與惡性腫瘤或其治療相關(guān)的痛苦的、長(zhǎng)時(shí)間的、主觀的、有關(guān)軀體、情感或認(rèn)知方面的疲乏感，與近期活動(dòng)量不符，并且影響正常生活［3］。何源源［5］等研究表明：CRF可以導(dǎo)致大鼠血漿中ATP水平降低，骨骼肌分裂增強(qiáng)，融合減弱，丙二醛合成增多和谷胱甘肽合成減少。本課題組對(duì)肺復(fù)康方的前期研究證明：肺復(fù)康方可通過(guò)提高IL-6水平、降低IL-1β和TNF-α水平，改善lewis肺癌小鼠炎癥因子失調(diào)狀態(tài)，有效緩解疲乏癥狀［6］。本實(shí)驗(yàn)以前期研究為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究肺復(fù)康方對(duì)肺癌CRF裸鼠骨骼肌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物和細(xì)胞株SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠25只（4周齡，重量在18～22g之間），購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證SCXK（湘）2019-0004。lewis肺癌細(xì)胞株（貨號(hào)ZQ0203），購(gòu)于中喬新舟廠家。

1.1.2 主要試劑及儀器實(shí)驗(yàn)試劑：肺復(fù)康方組方：百合 10g、赤芍 15g、丹參 15g、麥冬 10g、桑白皮 15g、瓜殼 10g、黃芩 10g、蚤休 10g、半枝連 15g、臭牡丹 10g、黃芪 20g、白術(shù) 10g、陳皮10g、谷麥芽各 10g、炮姜 10g、藿香 10g、神曲 10g。以上中藥顆粒劑均購(gòu)于湖南省腫瘤醫(yī)院中藥房。細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑：DEME basic（1X）高糖（貨號(hào)C11995500BT）、胰酶消化液（貨號(hào)25200056）、青鏈霉素（貨號(hào)15140122）以上均購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清（貨號(hào)04-001-1ACS），購(gòu)于BI公司；磷酸鹽緩沖液（貨號(hào)；SH3025601），購(gòu)于hyclone公司。BCA試劑盒（貨號(hào)HG-WDP0003a），購(gòu)于HonorGene公司；ATP試劑盒（貨號(hào)A095-1-1）、GSH試劑盒（A006-2-1）、MDA試劑盒（A003-1-2），以上均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。Drp1抗體（貨號(hào)ab184247），購(gòu)于英國(guó)abcam公司，Mfn1抗體（貨號(hào)13798-1-AP）和β-actin抗體（貨號(hào)66009-1-Ig）購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：HR1500-IIA2型生物安全柜、DW-86L728型醫(yī)用超低溫保存箱、BCD-269WDGG型冰箱（青島海爾電器有限公司）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CKX41型光學(xué)倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；5702R型低速冷凍離心機(jī)（EPPendorf公司）；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）；TS-1型搖床（其林貝爾公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一公司）；GL-88B型旋渦混合器（其林貝爾公司）；JB-13型磁力攪拌器和PHS-3C型精密PH計(jì)（中國(guó)雷磁公司）；BioPreP-24型生物樣品均質(zhì)儀（中國(guó)杭州奧盛公司）；自制小鼠鼠尾懸掛板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)將Lewis肺癌細(xì)胞株放入水浴鍋復(fù)蘇，后置于含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2，相對(duì)濕度95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，2～3d 傳代。

1.2.2 分組25只裸鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組，模型組，劑量組（肺復(fù)康方低劑量組、肺復(fù)康方中劑量組、肺復(fù)康方高劑量組）。同組裸鼠同盒飼養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境安靜。

1.2.3 建立肺癌CRF裸鼠模型將培養(yǎng)好的Lewis肺癌細(xì)胞用PBS溶液稀釋成1×107/mL細(xì)胞濃度，按照每只裸鼠0.2mL的量接種于模型組及劑量組裸鼠右側(cè)腋窩皮下。

1.2.4 疲乏狀態(tài)判定建模后第3周利用鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)明確各組裸鼠疲乏程度，判斷癌因性疲乏模型是否成功建立。將裸鼠尾巴末端2cm處固定在木板，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部距離地面約15cm，左右兩側(cè)用擋板隔離裸鼠視線，裸鼠為克服異常體位而掙扎活動(dòng)，力量耗竭后靜止不動(dòng)呈失望狀態(tài)，計(jì)算每只裸鼠6min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間，并同時(shí)觀察其掙扎幅度。

1.2.5 藥物干預(yù)及疲乏程度監(jiān)測(cè)根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，將肺復(fù)康方中藥顆粒劑配制為13g/kg（肺復(fù)康方低劑量組）、26g/kg（肺復(fù)康方中劑量組）和52g/kg（肺復(fù)康方高劑量組）。建模后第4周開始藥物干預(yù)，劑量組每只裸鼠每天給予0.4mL相應(yīng)劑量的中藥干預(yù)，早晚各給藥1次，每周間隔給藥5天，休息2天，共藥物干預(yù)3周。模型組和空白對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水干預(yù)。藥物干預(yù)的同時(shí)通過(guò)鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)（2次/周）判斷各組裸鼠疲乏程度，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)劑量組疲乏緩解情況。

1.2.6 裸鼠處死與取材藥物干預(yù)3周后，用頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖分離出后肢腓腸肌，置于冰塊中保鮮備用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組以及中、高劑量組均有1～2只不同數(shù)量裸鼠死亡，為保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，現(xiàn)取每組別3只樣本量。

1.2.7 裸鼠骨骼肌相關(guān)檢測(cè)WB法檢測(cè)骨骼肌內(nèi)Drp1和Mfn1蛋白含量。剪取0.025g組織，預(yù)冷PBS洗組織，加入250μL RIPA裂解液研磨，裂解10min，離心，提取蛋白，配制10%分離膠，灌膠，用異丙醇封膠。待凝膠，配制4.8%的濃縮膠，灌膠，取160μL蛋白上清，加入40μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5min，速冷備用。上樣10μL已變性蛋白，恒定電壓75V、時(shí)間為130min開始電泳，分別切膠Drp1（83KD），Mfn1（86KD），β-actin（42KD），給予 300 mA 持續(xù)電流轉(zhuǎn)膜，Drp1、Mfn1約100min，β-actin 約60min，配制5%脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1min顯色，暗盒內(nèi)與X膠片曝光5～20分鐘，顯影沖洗。

ELISA法檢測(cè)骨骼肌內(nèi)ATP、MDA、GSH水平：研磨組織，提取骨骼肌內(nèi)ATP，根據(jù)ATP、MDA和GSH測(cè)試盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，然后根據(jù)線粒體蛋白濃度進(jìn)行換算，得出各組骨骼肌中ATP、 MDA 和 GSH 的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS Statistics 25.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD或S-N-K檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺復(fù)康方對(duì)裸鼠行為學(xué)的影響建模后第3周對(duì)各組裸鼠進(jìn)行鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組裸鼠相比，模型組及劑量組失望時(shí)間均延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示癌因性疲乏模型建立成功。見表1。

表1 藥物干預(yù)前各組裸鼠失望時(shí)間表

藥物干預(yù)時(shí)對(duì)各組裸鼠進(jìn)行鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)判斷其疲乏情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：各時(shí)間點(diǎn)模型組和各劑量組失望時(shí)間均長(zhǎng)于空白組（P<0.05），藥物干預(yù)d3-d14各劑量干預(yù)組裸鼠失望時(shí)間與模型組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；藥物干預(yù)后，高劑量組d10、所有劑量組d17、d21裸鼠失望時(shí)間明顯短于模型組（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 干預(yù)時(shí)各組裸鼠失望時(shí)間表

2.2 肺復(fù)康方對(duì)裸鼠骨骼肌內(nèi)相關(guān)蛋白的影響應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)各組裸鼠骨骼肌內(nèi)蛋白表達(dá)情況，電泳圖顯示：Drp1蛋白表達(dá)：空白組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組。Mfn1蛋白表達(dá)：空白組>高劑量組>中劑量組>低劑量組>模型組（見圖1）。

圖1 各組骨骼肌蛋白Drp1、Mfn1蛋白印跡

與對(duì)照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內(nèi)Drp1數(shù)值均升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，中、高劑量組骨骼肌內(nèi)ATP數(shù)值均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組 Drp1數(shù)值雖下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮藥物劑量過(guò)低，藥效不明顯所致；劑量組組內(nèi)對(duì)比，Drp1含量分別是低劑量組>中劑量組>高劑量組，低劑量組和高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

與對(duì)照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內(nèi)Mfn1數(shù)值均下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，中、高劑量組骨骼肌內(nèi)Mfn1數(shù)值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組 Drp1數(shù)值雖升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮藥物劑量過(guò)低，藥效不明顯所致；劑量組組內(nèi)對(duì)比，Mfn1含量分別是低劑量組<中劑量組<高劑量組，低劑量組和高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 肺復(fù)康方對(duì)各組裸鼠骨骼肌內(nèi)蛋白的作用

2.3 肺復(fù)康方對(duì)裸鼠骨骼肌內(nèi)ATP、GSH、MDA的影響與對(duì)照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內(nèi)ATP數(shù)值均下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，劑量組骨骼肌內(nèi)ATP數(shù)值均明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；劑量組內(nèi)對(duì)比，ATP含量分別是低劑量組<中劑量組<高劑量組，任意兩組之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表4。

與對(duì)照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內(nèi)MDA數(shù)值均升高、GSH數(shù)值均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組相比，劑量組骨骼肌內(nèi)MDA數(shù)值均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高、中劑量組骨骼肌內(nèi)GSH數(shù)值均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組GSH數(shù)值雖升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮藥物劑量過(guò)低，藥效不明顯所致；劑量組內(nèi)對(duì)比：MDA數(shù)值分布為低劑量組>中劑量組>高劑量組，低劑量組與中劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中劑量組與高劑量組差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮劑量過(guò)高，肺復(fù)康方藥物毒副作用所致。GSH數(shù)值分布為低劑量組<中劑量組<高劑量組，低劑量組和高劑量組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組組間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 肺復(fù)康方對(duì)各組裸鼠骨骼肌內(nèi)ATP、GSH、MDA的影響

3 討論

研究表明，CRF發(fā)病率逐年攀升［7］，接受手術(shù)、化療、放療等相關(guān)治療的惡性腫瘤患者普遍存在疲乏癥狀，CRF可發(fā)生在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的任一過(guò)程，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量［8-9］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CRF的治療分為藥物干預(yù)和非藥物干預(yù)兩部分。藥物干預(yù)包括精神興奮劑、促紅細(xì)胞素（EPO）以及皮質(zhì)類固醇激素等［10］。非藥物干預(yù)包括體能鍛煉、心理指導(dǎo)、光療、營(yíng)養(yǎng)支持等［11-13］。中醫(yī)藥在CRF的治療方面發(fā)揮了重要作用，其方式多樣，療效顯著，中藥湯劑、針灸、穴位貼敷、中藥足浴等方式在臨床實(shí)踐中取得了良好的效果［14-17］。肺復(fù)康方是我院名中醫(yī)王云啟主任醫(yī)師總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，本課題組通過(guò)長(zhǎng)期臨床觀察發(fā)現(xiàn)肺復(fù)康方能夠有效改善肺癌CRF癥狀。

線粒體是機(jī)體進(jìn)行有氧呼吸、制造能量的細(xì)胞器，其主要作用是為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供能量，保持線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡是其正常功能的重要前提，這種動(dòng)態(tài)平衡一旦因某些因素被打破，機(jī)體會(huì)因線粒體功能失常而處于疾病狀態(tài)［5］。本實(shí)驗(yàn)研究得出，與空白對(duì)照組相比，劑量組及模型組均出現(xiàn)Mfn1表達(dá)減弱、Drp1表達(dá)增強(qiáng)，表明CRF裸鼠骨骼肌內(nèi)線粒體分裂增強(qiáng)，融合減弱，氧化損傷的線粒體數(shù)量增多，導(dǎo)致供能減少，呈現(xiàn)疲乏狀態(tài)。劑量組內(nèi)Mfn1含量高于模型組，Drp1含量低于模型組，表示肺復(fù)康方可上調(diào)Mfn1表達(dá)，下調(diào)Drp1表達(dá)，促進(jìn)線粒體融合，減少其氧化損傷，保證持續(xù)為機(jī)體供能

線粒體同時(shí)也是ATP合成的重要場(chǎng)所，ATP是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源，當(dāng)線粒體功能受損，ATP合成障礙，生物體會(huì)呈現(xiàn)疲乏狀態(tài)。MDA是由機(jī)體內(nèi)自由基和某些脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生，是機(jī)體氧化損傷的標(biāo)志［18］；GSH是機(jī)體抗氧化功能的指標(biāo)，其參加參與了脂質(zhì)過(guò)氧化物的清除［19］。當(dāng)機(jī)體骨骼肌內(nèi)MDA含量增多，GSH含量下降，則提示骨骼肌處于氧化損傷、供能障礙狀態(tài)，能量來(lái)源不足，機(jī)體表現(xiàn)出疲乏無(wú)力癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MDA、ATP含量：模型組<劑量組<空白對(duì)照組，GSH含量：空白對(duì)照組<劑量組<模型組。提示CRF裸鼠體內(nèi)MDA、ATP含量減少，GSH含量增多，肺復(fù)康方能夠通過(guò)增加MDA、ATP含量，減低GSH含量來(lái)緩解CRF癥狀。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立肺癌CRF裸鼠模型，肺復(fù)康方中藥干預(yù)，測(cè)定裸鼠骨骼肌內(nèi)Mfn1、Drp1蛋白含量及ATP、MDA、GSH含量，探究肺復(fù)康方對(duì)肺癌CRF裸鼠骨骼肌的干預(yù)機(jī)制。綜上可得結(jié)論：肺復(fù)康方能夠有效緩解CRF癥狀，其機(jī)制可能與興奮HPA軸，促進(jìn)CORT分泌、抑制ACTH合成，促進(jìn)骨骼肌融合，抑制其分裂，減少其氧化損傷有關(guān)。