HPLC法測定仙桃草中原兒茶酸的含量

劉華本*　李曉維　潘 旖　阮月華

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，浙江 德清 313200）

HPLC法測定仙桃草中原兒茶酸的含量

劉華本*李曉維潘 旖阮月華

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，浙江 德清 313200）

目的 建立以高效液相色譜法測定仙桃草中原兒茶酸含量的方法，并對原兒茶酸含量分布情況進(jìn)行探究。方法色譜柱為Phenomenex-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm）、Kromasil-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90），檢測波長為294 nm。結(jié)果原兒茶酸量在0.038～1.035 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r=0.999）；平均回收率為98.7%，RSD：1.4%。結(jié)論本法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于仙桃草藥材的質(zhì)量控制。

仙桃草；原兒茶酸；HPLC

仙桃草最常見的有兩種，一是仙桃草為玄參科婆婆屬植物仙桃草Veronica peregrina L.的帶蟲癭的全草，學(xué)名蚊母草，另一種為同科同屬的水苦荬V.undulata Wall［1］。本文研究對象為前者，其性味甘、苦、溫，《中華本草》記載主要功效為化瘀止血，清熱消腫；用于活血，止血，消腫，止痛。主要分布于東北、華東、華中、西南各地。其主要化學(xué)成分為原兒茶酸、木犀草素、香草酸等［2］，有人對其木犀草素的含量進(jìn)行了研究［3］?，F(xiàn)在以其為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品主要有仙桃草膏、仙桃草片等。本品在《中國藥典》1977年版一部及《浙江省中藥炮制規(guī)范》［4］有收載，《中國藥典》其后各版未再收入，本品進(jìn)一步研究和使用受到限制。仙桃草在《救荒本草》、《植物名實圖考》、《本草求原》等古籍中早有記載，民間偏方使用較廣，現(xiàn)代研究甚少。原收載只對其性狀及理化鑒別方法進(jìn)行描述，質(zhì)量控制方法簡單，藥材質(zhì)量難以保證。為了對其質(zhì)量進(jìn)行很好的控制，我們對其原兒茶酸（C7H6O4）含量測定方法進(jìn)行了研究，初步建立用HPLC方法測定仙桃草原兒茶酸含量，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于仙桃草的質(zhì)量控制.

1　儀器與材料

戴安UltiMate3000、P680液相色譜儀（美國熱電），Agilent 1260Infinity液相色譜儀（安捷倫公司），美國菲羅門公司C18（150 mm ×4.60 mm，5 μm），瑞典Kromasil C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），原兒茶酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）批號110809-201205（純度99.9%），仙桃草對照藥材（浙江省食品藥品檢驗研究院鑒定）批號050311，乙腈為色譜純，磷酸，乙醇均為分析純。

（批號20120301），由安徽和濟(jì)堂中藥飲片有限公司提供，為玄參科婆婆屬植物仙桃草Veronica peregrina L.的帶蟲癭的全草，為安徽省亳州地區(qū)野外生長品種。

2　方法與結(jié)果

2.1分析方法驗證

2.1.1色譜條件［5］：美國菲羅門公司（Phenomenex）C18（150 mm× 4.60 mm，5 μm）、瑞典Kromasil C18（150 mm×4.60 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90），檢測波長為294 nm，體積流量為1 mL/min，柱溫為常溫，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2供試品溶液制備：取本品適量，粉碎，使能通過三號篩，精密稱取粉末1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用20%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3對照品溶液的制備：稱取減壓干燥24 h的原兒茶酸（C7H6O4）對照品適量，精密稱定，加20%乙醇制成每1 mL約含80 μg的溶液，即得。

2.1.4系統(tǒng)適用性試驗：取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，原兒茶酸保留時間為5.2 min，理論塔板數(shù)不低于6000。HPLC圖譜見圖1、2。

2.1.5線性范圍：取含344.843 μg/mL原兒酸對照品溶液，精密量取對照品溶液1.25、2.5、5、10、20、30 mL，分別置于100 mL量瓶中，加20%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對照品溶液，分別精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品學(xué)溶質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：Y=31.685X+0.7433，得到原兒茶酸線性范圍0.038～1.035 μg，r=0.9999。

2.1.6加樣回收率試驗：精密稱取已知含量（0.132%）的樣品9份（批號20120301），每份0.5 g，分成3組，每組3份，每組分別精密添加0.8 mg/mL的原兒茶酸對照品溶液0.8、1、1.2 mL，按“2.1.2”項下方法制備的供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算其回收率和RSD，結(jié)果見表1。

2.1.7精密度試驗：從重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察本法的精密度。

2.1.7.1重復(fù)性試驗：相同條件下，精密量取“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份（批號20120301），重復(fù)進(jìn)樣，測定各次峰面積，計算樣品原兒茶酸含量分別為0.133%、0.134%、0.133%、0.132%、0.132%、0.133%，RSD為0.57%，表明本法重復(fù)性良好。

2.1.7.2中間精密度試驗：精密量取“2.1.2”項下方法制備的同一供試品溶液6份（批號20120301），不同日期（時間間隔期3 d）、不同分析員（2人）、不同設(shè)備進(jìn)行試驗（3臺不同型號的儀器），結(jié)果見表2。

2.1.7.3重現(xiàn)性試驗：精密量取“2.1.2”項下方法制備的同一供試品溶液6份（批號20120301），不同實驗室（質(zhì)量控制實驗室和研發(fā)中心實驗室），不同分析員（2人）分別進(jìn)行試驗，結(jié)果為：1號分析員質(zhì)量控制實驗室測試結(jié)果分別為0.134%、0.136%、0.131%；2號分析員研發(fā)中心實驗室測試結(jié)果分別為：0.133%、0.135%、0.132%.RSD%為1.41。

2.1.8耐用性試驗：從溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取時間、流動相的組成（如有機(jī)相的±5%）、不同品牌色譜柱、柱溫（如±5 ℃）、流速等進(jìn)行研究分析，試驗內(nèi)容如下：

2.1.8.1溶液的穩(wěn)定性試驗：溶液在室溫條件下，分別于0、1、3、5、8、12、24 h精密吸取10 μL供試品溶液（批號20120301），進(jìn)樣測定，結(jié)果RSD為0.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1　原兒茶酸對照品色譜圖

圖2　供試品溶液色譜圖

表1　仙桃草中原兒茶酸加樣加收試驗

表2　中間精密度試驗

2.1.8.2其他因素：對不同流動相的組成、不同品牌色譜柱、不同柱溫及流速進(jìn)行試驗，結(jié)果表明流動比例在±5%調(diào)整對結(jié)果影響不明顯，用菲羅門公司、Kromasil及月旭色譜柱結(jié)果無明顯變化，柱溫在10～30 ℃，流速在0.8～1.2 mL/min對結(jié)果無影響。因此，仙桃草中的原兒茶酸測定條件較寬，有較好的耐用性。

3　討　論

在供試品制備過程中，由于中藥成分的復(fù)雜性與提取的多樣性，曾對加熱回流時間進(jìn)行比較，回流分別為1、2、3 h，結(jié)果證明回流2 h，樣品提取完全，比較對經(jīng)濟(jì)合算，所以本實驗采取了加熱回流2 h的提取方法。

通過實驗研究，建立了仙桃草的原兒茶酸含量質(zhì)量控制方法，而且經(jīng)方法學(xué)驗證該方法穩(wěn)定可靠中，耐用性較強(qiáng)，可為仙桃草藥材質(zhì)量定量控制提供依據(jù)。同時對原兒茶酸含量在藥材中的分布情況進(jìn)行了初步研究，全草各部位均含有原兒茶酸，葉含原兒茶酸相對偏低，全草原兒茶酸含量為葉的2～3倍。

［1］楊成梓，凌偉堅.兩種仙桃草的本草考證［J］.中藥材，2003，26（11）: 818-819.

［2］都述虎，金繼曙.仙桃草主要化學(xué)成分體外促凝血作用［J］.中草藥，1996，27（7）:416-417.

［3］宋光偉，邢茂.HPLC法測定仙桃草中木犀草素的含量［J］.中國藥房，2009，20（15）:1166-1167.

［4］戚雁飛，諸葛隴.浙江省中藥炮制規(guī)范［M］.浙江:浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

［5］國家食品藥品監(jiān)督管理局.局頒標(biāo)準(zhǔn).仙桃草片［S］.2009.

R282.710.3

B

1671-8194（2015）22-0054-02