中藥復方促使Ｔ淋巴細胞增殖的實驗研究

張　輝　李玉虎

【摘要】 目的 研究中藥復方促使T淋巴細胞增殖。方法 從SD大鼠血液里分離淋巴細胞，進行體外培養(yǎng)。設正常細胞對照組、陽性藥物對照組、轉移因子組、復方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組。培養(yǎng)1 d后把藥加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，加Am-Blue細胞增殖與活性檢測試劑，避光培養(yǎng)4 h后，通過酶標儀檢測，分析淋巴細胞的增值情況。結果 中藥復方高、中、低劑量組OD值均明顯增高，與空白組比較P＜0.01；與陽性藥物對照組比較，P＜0.01；高劑量組與中、低劑量組比較P＜0.01；轉移因子組與空白組比較P＜0.01。結論 中藥復方能促使T淋巴細胞增殖，且與劑量有關。

【關鍵詞】 中藥復方；T淋巴細胞；增殖

Study on compound traditional chinese medicine promote toT-lymphocyte proliferation experiment

ZHANG Hui, LI Yu-hu. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Shanghai201203,China

【Abstract】Objective Study of compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation. Methods Separate T-lymphocyte from blood of SD rat, culture in vitro. Install normal cell control group, active-drug control group, transfer factor group, compound traditional Chinese medicinehigh dose group、middle dose group，low dose group. Give the medicine to culture medium after culture one day. Continue to culture 2 days and take Am-Blue into 96 orifice plate, culture 4 hours in dark. Use enzyme-labelling measuring instrument to measure after three days. Analyse proliferation of T-lymphocyte. Results OD of compound traditional Chinese medicine high dose group、middle dose group、low dose groupcan improve obviously. Theirs compare to blank control group P＜0.01; theirs compare to Active-drug control group P＜0.01; compound traditional Chinese medicinehigh dose group compare to middle dose group、low dose group P＜0.01. transfer factor group compare to blank control group P＜0.01. Conclusion Compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation, and relation to dosage.

【Key words】Compound traditional Chinese medicine; T-lymphocyte; Proliferation

轉移因子(Transfer factor TF)是從致敏動物的白細胞或脾臟、淋巴結等免疫器官中提取的一種低分子量多肽—核苷酸復合物，因其能將供體某種特定的細胞免疫功能特異地轉移給受體，故稱為轉移因子。目前對轉移因子的研究很多，本研究通過轉移因子與中藥的復方來研究中藥復方對體外培養(yǎng)的大鼠淋巴細胞的影響作用，分析復方轉移因子各種組別對細胞增殖的影響及與劑量的關系，為后續(xù)的體內試驗提供參考依據(jù)，探討復方中藥免疫增強作用和對復方轉移因子的臨床應用開發(fā)奠定基礎。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物SD大鼠，雄性，體質量（180±10）g，清潔級動物，中科院上海實驗動物中心提供。

1.1.2實驗室氣象條件溫度22℃～25℃，濕度40%～70%。

1.1.3試劑與儀器

1.1.3.1試劑 淋巴細胞分離液（Sigma公司）、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FCS）、Am-Blue細胞增殖與活性檢測試劑（SunBioTM公司）、PHA（植物凝集素）、IL-2（Sigma公司）；復方轉移因子，本實驗室制備。健康豬脾，用超濾儀超濾，得轉移因子溶液（10 mg/ml左右）。中藥（ 紫花地丁、野菊花、甘草等）煎煮2次，濃縮后加食用酒精提取。二者按一定的比例混合，得復方中藥。復方中藥中的轉移因子含量為0.05g/10ml和中藥生藥含量為5 g/10 ml。

1.1.3.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech公司））、Elx800酶標儀（美國BIO-TEK公司）。

1.2方法

1.2.1 采血

每次試驗均先麻醉SD大鼠，用5 ml注射器（預先抽取0.2 ml肝素）從大鼠腹主動脈抽血

3 ml。

1.2.2分離

將血液緩慢加入預先已加入淋巴細胞分離液的離心管中，血液與分離液的比例為1∶1。以

4℃、2000 r/min 離心20 min，液相分為三層，上層為自體血清層，中層為淋巴細胞層（乳白色云霧狀），下層為分離液和紅細胞層。用微量進樣器抽取淋巴細胞放入無菌的離心管中。

1.2.3 洗滌

將收集到的淋巴細胞集中于一支離心管中用PBS洗滌2次，均以2000r/min離心10 min，棄上清。

1.2.4 培養(yǎng)

洗滌后得到的淋巴細胞團用少量RPIM1640培養(yǎng)液(含10％血清)打散，用血細胞計數(shù)板統(tǒng)計調節(jié)細胞初始濃度至1×105，取160 μl轉入96孔培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。

1.2.5 分組

在96孔板中設置正常細胞組，陽性藥物對照組（含ＰＨＡ和ＩＬ－２），轉移因子組（TF組）復方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，同時設置空白對照孔（含培養(yǎng)液和Am-Blue試劑）。

1.2.6 加藥

培養(yǎng)一天后在正常細胞組中加入40 μl無菌生理鹽水，在陽性藥物對照組中加入40 μl PHA（100μg/ml）和IL-2，在TF組中加入40 μl TF，在復方中藥高劑量組中加入40 μl藥物，中劑量組中加入20 μl藥物和20 μl生理鹽水，低劑量組中加入5 μl藥物和35 μl生理鹽水。培養(yǎng)72 h后加入Am-Blue檢測試劑20 μl/孔。

1.2.7 檢測

培養(yǎng)4 h后，可見無熒光的靛青藍變?yōu)橛袩晒獾姆奂t色，上酶標儀檢測。以570 nm波長檢測各孔OD值。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差( ±s)表示,用統(tǒng)計軟件SPSS13.0 進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法用單因素方差分析。

2 結果

2.1 藥物組與正常細胞組比較對淋巴細胞增值的影響（見表1）。

由表1可知，陽性藥物對照組，轉移因子組，復方中藥高、中、低劑量組均極顯著地促進淋巴細胞的增值，P＜0.01。6個藥物組促進淋巴細胞增殖的強弱順序依次為復方中藥高劑量組＞復方中藥中劑量組＞復方中藥低劑量組＞TF組＞陽性藥物對照組。

2.2 復方中藥組、TF組與陽性藥物組比較對淋巴細胞增殖的影響（見表1）

由表1可知，復方中藥高、中、低劑量組與陽性藥物組比較P＜0.01；TF組與陽性藥物組比較P＜0.01。

2.3復方中藥組高、中、低劑量組比較對淋巴細胞增殖的影響（見表1）

由表1可知，復方中藥高、中劑量組與低劑量組比較P＜0.01。 可見復方中藥對淋巴細胞的增值作用與劑量關系密切。

3 討論

機體免疫系統(tǒng)中淋巴細胞增殖是機體對非己抗原刺激產生免疫應答過程中的重要事件。淋巴細胞增殖結果表現(xiàn)為產生效應淋巴細胞。清除非己抗原，維護機體內環(huán)境穩(wěn)定。T細胞活化是細胞免疫應答早期的重要變[1],化淋巴細胞增殖效果決定效應淋巴細胞的數(shù)量，決定了機體免疫應答反應的強度，反映機體的細胞免疫狀態(tài)[2]。因此，淋巴細胞增殖實驗的結果是細胞免疫的一個測定指標。

轉移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和動物免疫淋巴細胞內的可透析的小分子物質，屬于多肽和多核苷酸類，分子質量大約為3～15 ku。TF成分復雜，它能夠特異性將供體細胞免疫力傳遞到受體細胞內，特異性地增強受體免疫功能，是一種新型免疫激發(fā)劑，且具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、調節(jié)免疫功能、增強機體非特異性細胞免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發(fā)劑，細胞免疫的增強劑、細胞免疫調節(jié)劑及干擾素產生啟動劑[3]。轉移因子自1953被Sherwood Lawrence[4]發(fā)現(xiàn)以來,作為具有特異和非特異性免疫活性的細胞調節(jié)因子,免疫增強劑已顯示出其廣闊的應用前景,也吸引著大批國內外科學工作者從事轉移因子實驗及臨床研究。轉移因子對各類疾病的治療機理的報道也日趨增多。目前很多學者將TF應用于特種經(jīng)濟動物傳染病的治療，取得較大的進展[5]。

PHA和IL-2能促使體外淋巴細胞增殖，IL-2是淋巴細胞體外增殖的必備條件。本實驗PHA和IL-２的用量分別是100 μg/ml、100 μg/ml。本實驗使用Am-Blue 細胞增殖與活性檢測試劑來替換MTT。Am- Blue 細胞增殖與活性檢測試劑是一種能簡便、迅速、可靠地定量檢測多種動物細胞系、細菌、真菌增值與活性的試劑。與MTT相比有以下優(yōu)點：1，操作簡捷，一步到位；2，無細胞毒，后續(xù)可用；3，應用廣泛，用途多樣；4，雙色檢測，靈敏度高；兼容性強，穩(wěn)定性好。如今在國外使用頻繁。

本實驗結果顯示，8個組均能不同程度低促進淋巴細胞的增值，復方中藥組明顯優(yōu)于其他組，尤以復方中藥組促進淋巴細胞增值的作用最佳，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示復方中藥可以促進淋巴細胞的增值，且效果明顯，中藥與轉移因子組成的復方不是簡單的相加，它們在發(fā)揮免疫調節(jié)功能時具有協(xié)同促進作用。這為進一步探討復方中藥的臨床應用奠定基礎。

參考文獻

[1] 侯會娜,曾耀英，等. 金銀花提取物對小鼠淋巴細胞體外活化與增殖的影響.免疫學雜志，2008，24（2）：183.

[2] 趙潔，王曦鳴，李繼祥. MTT法檢測淋巴細胞增殖能力的影響因素.畜禽業(yè)，2008，226（2）：28.

[3]孫衛(wèi)民，王惠琴．細胞因子研究方法學.人民衛(wèi)生出版社，2001.

[4] Lawrence HS. The transfer in humans of delayed skin sensitivity to Streptococcial M

substances and to tuberculin with disrupted leukocytes. J Clin Invest，1955，34:219-

230.

[5] 常建軍. 轉移因子的研究現(xiàn)狀及臨床應用進展.青海大學學報（自然科學版），2007，25(2):34-35.