P21WAF1和cyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中表達的研究

趙勁松， 廖克龍， 楊 康

近年來我國食管癌的發(fā)病率有明顯上升的趨勢，40歲以上人群是食管癌的高發(fā)群體，我國的食管癌以鱗狀細胞癌為主，發(fā)現(xiàn)病變的時間一般都偏晚，總的5年生存率不到30%[1]。細胞周期蛋白激酶抑制因子P21WAF-1是一種CDK抑制蛋白(CDKIs)，他通過與cyclin/CDK復(fù)合物的結(jié)合抑制其生物活性，阻止細胞通過G1/S的調(diào)節(jié)位點,對細胞周期起著負調(diào)控的作用,是一種抑癌基因。本實驗通過檢測P21和cyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中的表達情況,評價其與食管鱗癌臨床、病理的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本收集和處理

80例食管鱗癌組織及80例正常食管組織取自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院胸心外科2005年3月到2006年4月食管鱗癌接受手術(shù)治療的患者，年齡40～68歲。術(shù)前均未接受放療或化療。臨床病理特征見表1，每例標(biāo)本取癌組織和距離癌塊邊緣4 cm的正常食管組織各2塊，經(jīng)10%福爾馬林浸泡24 h固定，石蠟包埋，連續(xù)切片4張，厚度為4 μm，分別貼于涂有防脫片劑(10%多聚賴胺酸)的玻片上，進行HE染色和免疫組化染色。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 主要試劑 鼠抗人cyclinD1單抗購于Santa-Cruz公司。鼠抗人P21單抗、SP9000試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中山金橋公司。

1.2.2 基本步驟 采用SP三步法，染色步驟按SP9000試劑盒的說明書進行。組織切片用PBS液(pH 7.4)沖洗，在滴加3%的過氧化氫溶液前使用微波爐抗原熱修復(fù)，加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入組織芯片加熱20 min；常規(guī)DAB顯色，顯微鏡下觀察，在背景顏色過深前終止反應(yīng)。P21抗體的工作濃度為1∶40,cyclinD1抗體的工作濃度為1∶200。

1.2.3 實驗結(jié)果判別 P21陽性細胞的顯色部位在細胞核，為棕黃色，cyclinD1的陽性細胞多數(shù)在細胞核,少數(shù)在胞漿,圖像分析采用image pro plus5.0圖像分析軟件，陽性細胞<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為(++)，51%～75%為(+++)，76%～100%為(++++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗，列聯(lián)表分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察

80例癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理科進行HE染色確診(見圖a、b)，并按分化程度分級(見表1)。

圖a和圖b為食管鱗癌組織的HE染色，圖c為正常食管黏膜上皮，圖d為分化程度2級的P21染色，圖e為分化程度1級的P21染色，圖f為P21陰性的免疫組化染色，圖g和圖h為食管鱗癌組織的cyclinD1蛋白免疫組化染色。

2.2 P21和cyclinD1的陽性表達及分布特點

(1)正常的食管黏膜組織：在正常的食管黏膜組織上皮細胞中，P21的表達主要集中在生長分裂旺盛的基底層細胞，在成熟的上皮細胞中則基本上不表達(見圖c),而cyclinD1在正常食管組織中基本上不表達。(2)食管鱗癌組織：P21廣泛高水平表達于癌細胞中，呈灶狀或者彌漫性分布，部位主要在細胞核(見圖d、e)，cyclinD1同樣高水平表達于細胞核,少數(shù)胞漿也有表達(見圖g、h)。

表1 P21的表達與臨床病理特征的關(guān)系

注：食管癌TNM分期采用的是國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1987年的分期標(biāo)準(zhǔn)

2.3 P21和cyclinD1的表達特點

從正常的食管黏膜到癌組織P21呈現(xiàn)表達增加的趨勢，同時在P21強陽性的切片中cyclinD1均有高水平的表達(見表2)。P21和cyclinD1在正常食管組織和癌組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 P21與cyclinD1蛋白在食管鱗癌中表達的關(guān)系

2.4 P21的表達與臨床病理特征的相關(guān)性

食管鱗癌患者的臨床病理特征和P21表達的相關(guān)性見表1，采用列聯(lián)表分析的方法，P21的表達與患者性別、年齡、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無直接相關(guān)性，但與患者有無吸煙史、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期密切相關(guān)，在P21高表達的患者中食管癌細胞的分化程度一般較低，預(yù)后較差。

3 討論

P21基因定位于6p21.2，其DNA長度為85kb，由3個外顯子組成，因編碼分子量為21KD的蛋白質(zhì)而得名。目前的研究表明腫瘤的發(fā)病機制與細胞周期素蛋白(cyclins)、依賴周期素蛋白激酶(CDKs)以及CDK抑制蛋白(CDKIs)的調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)[2]，P21作為CDKIs的重要一族主要在兩個方面對細胞增殖發(fā)揮負性的調(diào)控作用。一是P21的N端有顯著的序列同源性，包含一個廣譜的與cyclin-CDKs復(fù)合物作用的位點，P21是細胞周期中G1/S限制點的“開關(guān)”，通過與cyclin-CDKs復(fù)合物的結(jié)合抑制其活性，使細胞發(fā)生G1期的停滯。二是其C端可以結(jié)合并抑制PCNA，使DNA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動，從而影響DNA的復(fù)制，抑制了細胞的分裂增殖。而cyclinD是細胞周期運行的起始因子，其表達完全依賴于生長因子[3]，自G1早期表達后其水平持續(xù)整個生長周期，而其他cyclins的表達都是后來被促進的，cyclins和CDKs形成全酶復(fù)合物是細胞分裂增殖過程中的必需條件。

本實驗結(jié)果表明，在分裂增殖旺盛的正常食管黏膜基底層細胞中P21有少量的表達，陽性細胞總數(shù)<5%，而在食管鱗癌組織中則呈廣泛的高水平表達。此結(jié)果與P21WAF-1作為抑癌基因的功能不一致，分析其原因可能有：(1)突變學(xué)說：P21在腫瘤細胞中突變，功能部分喪失，依賴P53激活的途徑是P21作為抑癌基因作用最為廣泛的途徑，但是目前的研究表明體內(nèi)多種惡性腫瘤組織的P21表達與P53無關(guān)[4]，可能與細胞損傷修復(fù)機制有關(guān)，雖然P21數(shù)量增多但是不能有效地抑制細胞的分裂增殖。(2)反饋學(xué)說：Harper等[5]的研究表明cyclin-CDKs復(fù)合物的活性轉(zhuǎn)變?nèi)Q于結(jié)合P21分子的數(shù)目，在無活性的復(fù)合物上通常結(jié)合了多個P21，兩者存在數(shù)量上依賴的關(guān)系。在腫瘤細胞分裂過程中cyclinD1以及cyclin-CDKs復(fù)合物濃度有明顯的提高，這種反饋使P21為了抑制腫瘤細胞的分裂增殖必須提高其濃度，增加與復(fù)合物的結(jié)合，抑制其生物活性，但是P21對cyclins-CDKs二元復(fù)合物沒有產(chǎn)生明顯的抑制作用。另一方面，Gulbis等[6]的研究發(fā)現(xiàn)P21的C端與PCNA以1∶1或1∶3的比例結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制，在分裂增殖旺盛的食管鱗癌組織，這兩方面的因素都可能增加P21的表達。(3)P21自身的調(diào)控失常：P21的自身調(diào)控有依賴P53途徑和非依賴P53途徑，還與P21轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)。(4)可能與組織的類型相關(guān)：不同類型來源的組織P21的作用可能不一致。徐建芳等[7]的研究發(fā)現(xiàn)P21在非小細胞肺癌中呈高水平表達，而在正常肺組織中基本不表達。錢小飛等[8]的實驗表明在喉鱗癌組織中也存在P21的高水平表達，說明P21在不同組織中的作用可能不一致。本實驗證實cyclinD1作為細胞生長分裂所必需的蛋白，在正常食管組織中基本不表達，在食管鱗癌組織中則呈高水平表達，而且與P21的表達水平基本一致，表明在食管鱗癌細胞的分裂增殖過程中兩者可能存在數(shù)量上的對應(yīng)關(guān)系。

P21在正常食管組織的表達水平遠遠低于癌組織，并且與患者的吸煙史、腫瘤分化程度以及腫瘤TNM分期密切相關(guān)。食管癌細胞的分化程度以及食管癌的TNM分期是影響患者預(yù)后的重要因素之一，這表明P21蛋白作為一個重要的標(biāo)記物，可成為預(yù)測食管癌預(yù)后的潛在指標(biāo)。

[1] Xia HHX, Zhang ST, Lam SK,et al. Expression of macrophage migration inhibitory factor in esophageal squamous cell carcinoma and effects of bile acids and NSAIDs[J]. Carcinogenesis, 2005, 26(1):11-15.

[2] Ewen ME,Sluss HK,Sherr CJ,et al.Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins[J].Cell, 1993,73(3):487-497.

[3] Hulleman E, Boonsha J. Regulation of G1 phase progression by growth factors and the extracellular matrix[J]. Cell Mol Life Sci, 2001, 58(1):80-93.

[4] Palazzo JP，Kafka NJ，Grasso L, et al. The role of P53，P21Waf-1/CIPland bcl-2 in radioresistant colorectal carcinoma[J].Hum pathol,1997,28(10):1189-1195.

[5] Harper JW, Elledge SJ, Keyomarsi K, et al. Inhibition of cyclin-dependent kinases by p21[J]. Mol Biol Cell,1995, 6(4):387-400.

[6] Gulbis JM,Kelman Z,Hurwitz J,et al. Structure of the C-terminal region of p21WAF1/CIP1complexed with human PCNA[J].Cell, 1996, 87(2):297-306.

[7] 徐建芳，周彩存，易祥化，等.P21WAF1和VEGF在非小細胞肺癌中的表達及臨床相關(guān)性研究[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2003,10(6)：495-498.

[8] 錢小飛，孫秀蘭，殷朝興.喉鱗癌中P21WAF1/CIPl、C-erbB-2的表達及其臨床意義[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報,2005,19(5)：324-328.