檸檬苦素誘導(dǎo)塔賓曲霉UA13高產(chǎn)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的研究

陳鈺亭,李文杰,楊睿昕,雷生姣*,王順順,楊丹丹,歐陽(yáng)儂非

1(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌,443002)2(河南工業(yè)大學(xué) 國(guó)際教育學(xué)院,河南 鄭州,450000)

柑橘類水果兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值,富含人體生長(zhǎng)發(fā)育必須的維生素、膳食纖維、以及類黃酮類等生物活性物質(zhì)[1],具有抗氧化[2]、抗癌[3]、肝臟保護(hù)[4]、延緩衰老[5]和預(yù)防各種慢性疾病等功效[6],深受消費(fèi)者的喜愛。相較于國(guó)外柑橘深加工業(yè),我國(guó)的發(fā)展仍處于初級(jí)階段,柑橘加工業(yè)滯后于種植業(yè),具有非常大的增長(zhǎng)空間。檸檬苦素類化合物(limonoids)的典型代表物——檸檬苦素(limonin),是柑橘類水果出現(xiàn)苦味和“后苦味”的主要物質(zhì)[7],極大地影響了柑橘汁的口感,而“后苦味”則嚴(yán)重制約了柑橘加工業(yè)的發(fā)展,亟待解決。檸檬苦素[8]又稱檸堿,是一種三萜化合物,在水溶液中的苦味閾值為1.0 mg/L,在果汁中的苦味閾值為3.4 mg/L,約為柚皮苷的20倍[9]。檸檬苦素在鮮果或鮮榨果汁中含量較低,多以無(wú)苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),但長(zhǎng)時(shí)間放置或熱處理等會(huì)使其苦味加劇[10]。如圖1所示,這種“后苦味”現(xiàn)象是由于在酸性條件(pH<6.5)下,檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯在檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)酯水解酶催化下轉(zhuǎn)化為有苦味的檸檬苦素[11]。果肉組織在冰凍[12]、機(jī)械損傷[13]或熱處理[14]等條件下,其酸度均會(huì)增強(qiáng),進(jìn)而促進(jìn)了加工或貯藏過(guò)程中檸檬苦素的生成[15]。

圖1 檸檬苦素A環(huán)內(nèi)酯催化為檸檬苦素的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the catalysis of limonin A-cyclic lactone to limonin

前期研究顯示,本實(shí)驗(yàn)室選育的ARTP誘變菌株塔賓曲霉UA13[16]能同時(shí)水解柚皮苷和檸檬苦素,但對(duì)檸檬苦素的水解能力較弱。因此,本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以檸檬苦素為誘導(dǎo)物對(duì)該菌株進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo),以期提高其產(chǎn)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的能力。在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上進(jìn)行1 L發(fā)酵罐優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件,并對(duì)所得到的酶進(jìn)行性質(zhì)研究,為建立可同時(shí)水解兩種柑橘苦味物質(zhì)的酶制劑技術(shù)奠定理論基礎(chǔ),并為微生物發(fā)酵技術(shù)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室菌株塔賓曲霉(Aspergillustabin)UA13,保藏編號(hào)M 2022989,本實(shí)驗(yàn)室初次分離誘變保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基[16](g/L):MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,KNO31.5,CaCl20.1,酵母提取物 2.0,檸檬苦素1.0 mg/L,瓊脂粉 10.0,自然pH。

種子培養(yǎng)基(g/L):檸檬苦素4.0 mg/L,MgSO4·7H2O 5.0,K2HPO45.0,KCl 5.0,FeSO4·5H2O 0.1,瓊脂粉10.0,自然pH,接種量10%(體積分?jǐn)?shù))。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41.5,K2HPO41.5,(NH4)2SO44.0,ZnSO4·7H2O 0.1,CaCl20.1,酵母提取物 1.0,豆粉 2.0,蛋白胨 2.0,檸檬苦素4.0 mg/L,自然pH,接種量10%(體積分?jǐn)?shù))。

1.1.3 試劑

檸檬苦素(標(biāo)準(zhǔn)品≥98%)、對(duì)-二氨基苯甲醇(分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;柚皮苷(分析純),上海源葉生物科技有限公司;CH3COOH、CH3COONa、一縮二乙二醇(diethylene glycol,DEG)、95%乙醇、無(wú)水乙醇、NaOH、H2SO4、FeCl3(均為分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子天平,梅特勒-托厲多儀器(上海)有限公司;ZW0615062604紫外可見光分光光度儀,上海光譜儀器有限公司;HENCZI紅外快速干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;SX700高壓蒸汽滅菌鍋,日本TOMY公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、SPX-605-II生化恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;IS09001恒溫?fù)u床,世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FUG-1L×4-P發(fā)酵罐,上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司;LG10-2.4A離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-2恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司;XSP-7CZ生物顯微鏡,上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司;渦旋振蕩儀,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

孢子懸浮液:將實(shí)驗(yàn)室貯藏的斜面菌株塔賓曲霉UA13接種于平板培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)3～4 d至孢子成熟。用0.85%的無(wú)菌生理鹽水洗下孢子并打散,得到菌懸液。對(duì)孢子懸液進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù),將濃度調(diào)整為107個(gè)/mL左右即可。

種子液:將調(diào)整好濃度的孢子懸浮液按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。

菌種發(fā)酵:將調(diào)整好的孢子懸浮液用無(wú)菌槍頭吸取5 mL(接種量10%,體積分?jǐn)?shù))接入已滅菌的裝液量50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5顆玻璃珠)。于30 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h。

1.3.2 酶活力測(cè)定

a)粗酶液的制備:取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液于離心管中,5 000 r/min離心20 min。

b)檸檬苦素含量的測(cè)定:參照王菁等[17]方法并進(jìn)行改進(jìn),分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL的200 μg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL具塞試管中,無(wú)水乙醇補(bǔ)足至2 mL,再各加入5 mL顯色液,充分搖勻后靜置顯色30 min,在500 nm下測(cè)定吸光度。以檸檬苦素含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,為A=0.003 8C+0.037 9,R2=0.999 7。

顯色液的配制(現(xiàn)配現(xiàn)用):精確稱取125 mg的對(duì)二氨基苯甲醛溶解于100 mL的硫酸-無(wú)水乙醇混合液,V(對(duì)二氨基苯甲醛)：V(硫酸-無(wú)水乙醇)=65：35(冷卻后使用),再加入0.5 mL,體積分?jǐn)?shù)0.9%的FeCl3,混勻即可。

c)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力測(cè)定:參照田慶國(guó)等[18]方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn),于具塞試管中加0.5 mL、200 μg/mL底物檸檬苦素,再加入0.1 mL一定濃度的酶液,用無(wú)水乙醇補(bǔ)足到2 mL。將其置于60 ℃的恒溫振蕩器(150 r/min)中酶解30 min,取出酶解液立即置于100 ℃的沸水浴中滅活5 min;于酶解液中添加5 mL的顯色液,混勻后靜置顯色30 min。取出注入1 cm比色皿內(nèi),用分光光度計(jì)在500 nm處測(cè)定吸光值。

所有樣品平行測(cè)定3次,取平均值進(jìn)行分析(下同)。

酶活力定義:在60 ℃,pH 4.0的條件下,1 min消耗1 μg檸檬苦素所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

相對(duì)酶活力定義:同組實(shí)驗(yàn)中最高酶活定義為100%,其他條件下酶活力值與最高值之比×100定義為相對(duì)酶活力(%)。

1.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.4.1 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

以檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)探究菌株的最佳產(chǎn)酶條件。在初始培養(yǎng)條件下,接種一定種齡的種子液,改變發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量(4%～16%,體積分?jǐn)?shù))、發(fā)酵溫度(25～40 ℃)、發(fā)酵液初始pH值(4.0～9.0),確定菌株最佳的發(fā)酵環(huán)境。

1.4.2 1 L發(fā)酵罐優(yōu)化試驗(yàn)

1 L發(fā)酵罐四聯(lián)罐同步連續(xù)發(fā)酵,將種子液同步培養(yǎng)后接種至600 mL的已滅菌發(fā)酵液中(接種量10%,體積分?jǐn)?shù))。在通氣量0.4 L/min,攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min,初始pH值為5.0的初始條件下進(jìn)行放大培養(yǎng)。在搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上,分別對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速(200～350 r/min)、發(fā)酵溫度(25～40 ℃)、發(fā)酵初始pH值(4.0～7.0)進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)酶情況確定最適產(chǎn)酶條件。

酶活力提高倍數(shù)的分析以搖瓶發(fā)酵優(yōu)化后的酶活力為基礎(chǔ)進(jìn)行比較研究。

1.5 酶的底物親和性和酶的最適反應(yīng)條件研究

酶最適反應(yīng)條件:發(fā)酵液離心后的上清液即為粗酶液。探究粗酶液在不同酶解溫度(30～70 ℃)和pH值(2.0～8.0)對(duì)酶活力的影響及其對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。以同組實(shí)驗(yàn)中測(cè)定最高酶活力為100%,計(jì)算其他條件下的相對(duì)酶活力。

酶的底物親和性:測(cè)定酶催化3種底物(檸檬苦素、柚皮苷、橙皮苷)的米氏常數(shù)Km值,探究酶對(duì)底物的親和性,采用雙倒數(shù)法(Linewear-Burk)求得Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.1.1 菌株接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

種子液的濃度以及菌種的生理狀態(tài)會(huì)直接影響發(fā)酵效果[19]。種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的時(shí)間一定程度上決定了種子活力的強(qiáng)弱,特別是絲狀真菌,其菌體的形態(tài)和養(yǎng)分傳質(zhì)都會(huì)受到影響。在前期研究的基礎(chǔ)上,以不同接種量接種48 h的種子培養(yǎng)基到搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng),菌株產(chǎn)酶活力如表1所示。

表1 不同接種量對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Table 1 Effects of different inoculum amounts on enzyme production by strain UA13

接種量的多少對(duì)發(fā)酵周期有直接的影響,接種量過(guò)低,菌株密度小,生長(zhǎng)周期延長(zhǎng);接種量過(guò)高,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)不足,菌體營(yíng)養(yǎng)不良,產(chǎn)酶能力也會(huì)下降[20]。由表1可知,接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的活力影響較小。接種量在4%～10%(體積分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)時(shí),菌株產(chǎn)酶能力均維持在相對(duì)較高的水平,活力最高達(dá)6.68 U/mL。綜合考慮產(chǎn)酶活力與發(fā)酵時(shí)間,本研究確定接種量10%(體積分?jǐn)?shù))作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)(下同)。

2.1.2 菌株發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

改變發(fā)酵溫度,探究菌株產(chǎn)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的最適培養(yǎng)溫度,結(jié)果如表2所示。

表2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of different fermentation temperature on enzyme production by strain UA13

不同微生物適宜的培養(yǎng)溫度不同,溫度會(huì)影響菌株的代謝及生長(zhǎng)狀態(tài),從而影響產(chǎn)酶能力[21]。由表2 可知,菌株在25～40 ℃發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),菌株產(chǎn)酶活力隨培養(yǎng)溫度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),酶活在35 ℃時(shí)達(dá)到最大(10.09 U/mL)。因此,本研究采用發(fā)酵溫度35 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的初始pH值會(huì)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的電荷狀況等造成影響[22]。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也會(huì)造成培養(yǎng)基的pH值發(fā)生變化。不同菌株生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)酶的適宜pH值范圍不同。由表3可知,發(fā)酵初始pH值為5.0～6.0時(shí),菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力較強(qiáng),初始pH 5.0時(shí),酶活力最高可達(dá)11.60 U/mL。因此,本研究采用初始pH 5.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 發(fā)酵初始pH值對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Table 3 Effects of different fermentation initial pH on enzyme production by strain UA13

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以9.0 mg/L的檸檬苦素為碳源兼誘導(dǎo)物,接種10%(體積分?jǐn)?shù))發(fā)酵48 h的種子培養(yǎng)基,在初始培養(yǎng)基pH 5.0,發(fā)酵溫度35 ℃條件下發(fā)酵72 h,菌株UA13產(chǎn)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的最高酶活力可達(dá)11.60 U/mL。

2.2 發(fā)酵罐優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為了提高微生物發(fā)酵水平,在搖瓶實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,開展實(shí)驗(yàn)室小型發(fā)酵罐優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵過(guò)程中溶氧的變化能夠反映菌株生長(zhǎng)狀態(tài)[23]。如圖2所示,發(fā)酵開始24 h菌體處于遲滯期,溶氧急劇下降,培養(yǎng)基中的氧氣被充分利用。隨后,溶氧開始逐漸上升,酶的生物合成開始,菌體進(jìn)入生長(zhǎng)指數(shù)期,酶活力開始持續(xù)增加,發(fā)酵72 h酶活力達(dá)到最高,為25.48 U/mL,與優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵的最高酶活力(11.60 U/mL)相比提高了119.7%。培養(yǎng)基的pH值是動(dòng)態(tài)變化的,其值從發(fā)酵開始迅速下降,隨后逐漸上升,最后在4.3～4.8波動(dòng)。

圖2 未優(yōu)化發(fā)酵條件下菌株UA13于1 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of strain UA13 in 1 L fermenter under unoptimized fermentation conditions

2.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

在搖瓶培養(yǎng)時(shí)通過(guò)搖床轉(zhuǎn)動(dòng)以及添加適量的玻璃珠來(lái)促進(jìn)各物質(zhì)的融合,避免菌絲體結(jié)團(tuán)而影響發(fā)酵產(chǎn)酶。從搖瓶放大至發(fā)酵罐中,攪拌參數(shù)的控制很大程度上決定著罐體內(nèi)物質(zhì)混合和發(fā)酵產(chǎn)酶的效率。若攪拌速度過(guò)快,過(guò)大的剪切力會(huì)影響細(xì)胞的生成和組成,對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)酶造成不利影響[24];若攪拌轉(zhuǎn)速過(guò)低,菌絲體纏繞成團(tuán),不利于發(fā)酵生產(chǎn)。

如圖3所示,攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí),由于攪拌轉(zhuǎn)速較低,菌絲體生長(zhǎng)較慢,遲滯期較長(zhǎng),36 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。菌體產(chǎn)酶能力在48 h時(shí)達(dá)到最大,為34.04 U/mL,隨后持續(xù)下降。而搖瓶實(shí)驗(yàn)可知菌株通常在72 h時(shí)產(chǎn)酶活力達(dá)到最高,造成差異的原因可能是發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速過(guò)低,菌絲體在后續(xù)未繼續(xù)斷裂繁殖,而是大量纏繞成球在罐內(nèi)擋板上影響產(chǎn)酶;攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí),發(fā)酵罐中的溶氧增加,但過(guò)高的剪切力會(huì)加速菌絲體的衰亡,發(fā)酵60 h時(shí)酶活力達(dá)到最高(33.78 U/mL);轉(zhuǎn)速為250、300 r/min時(shí)的發(fā)酵變化趨勢(shì)相差不大:菌株在250 r/min轉(zhuǎn)速下,于48 h時(shí)酶活力達(dá)到最高(42.61 U/mL),提高了267.3%。菌株在300 r/min轉(zhuǎn)速下,于60 h時(shí)酶活達(dá)到最高(43.23 U/mL),提高了272.7%?？紤]到實(shí)際發(fā)酵中節(jié)省能源,且兩種轉(zhuǎn)速下的酶活力相差不大,選擇250 r/min為最優(yōu)轉(zhuǎn)速更為適宜。

a-酶活;b-溶氧圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different stirring speeds on enzyme production by strain UA13

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵溫度會(huì)通過(guò)影響發(fā)酵液的性質(zhì)和溶氧而對(duì)酶的生物合成造成影響,適宜的發(fā)酵溫度有利于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累[25]。

如圖4所示,不同溫度下的菌株發(fā)酵曲線趨勢(shì)基本一致:當(dāng)發(fā)酵溫度控制在25 ℃和40 ℃時(shí),酶活力均在48 h達(dá)到最高,分別為28.80 U/mL和30.46 U/mL,酶活力相對(duì)較低,與搖瓶發(fā)酵情況一致;在30、35 ℃時(shí),菌株產(chǎn)酶活力在36 h分別達(dá)到40.10、35.61 U/mL,在發(fā)酵60 h時(shí)兩者均出現(xiàn)二次生長(zhǎng)。綜上所述,菌株在30～35 ℃均有良好的產(chǎn)酶能力,在30 ℃的培養(yǎng)溫度下,菌株提前在36 h酶活力就達(dá)到最高40.10 U/mL,相較于優(yōu)化前提高了245.7%,縮短了發(fā)酵周期。因此,選擇培養(yǎng)溫度30 ℃進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵罐優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

a-酶活;b-溶氧圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of different fermentation temperatures on enzyme production by strain UA13

2.2.3 發(fā)酵液初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖5所示,在初始pH 5.0條件下,發(fā)酵前12 h,溶氧迅速下降。在12～48 h,發(fā)酵罐的溶氧趨近于零,基本維持10%以下,說(shuō)明初始pH 5.0條件下菌株代謝旺盛,更適宜生長(zhǎng),與搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在48 h時(shí),檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力已達(dá)到48.52 U/mL,相較于優(yōu)化前提高了318.3%;在發(fā)酵初始pH 6.0條件下,菌株在48～72 h都維持著較好的產(chǎn)酶能力,酶活最高可達(dá)40.16 U/mL,提高了246.2%;發(fā)酵液初始pH 4.0時(shí),酶在96 h時(shí)達(dá)到最高活力,為38.82 U/mL,提高了234.7%。綜上所述,發(fā)酵液的最適初始pH值為5.0,且塔賓曲霉UA13在初始pH 4.0～6.0的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力較強(qiáng),此菌株更適宜在偏酸環(huán)境中生存,與搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

a-酶活力;b-溶氧圖5 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌株UA13產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different fermentation initial pH on enzyme production by strain UA13

2.3 檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)研究

2.3.1 檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶最適酶解溫度的研究

溫度是影響底物轉(zhuǎn)化效率的重要因素。溫度過(guò)低時(shí),許多酶分子未被激活,酶解效果極低。溫度過(guò)高超過(guò)酶熱穩(wěn)定性范圍時(shí),酶蛋白失活[26]。適宜的酶解溫度可以使底物的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大。

由表4可知,酶解溫度在30～70 ℃時(shí),檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的活力隨溫度升高呈先增加后下降的趨勢(shì),在60 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最高,為16.50 U/mL;當(dāng)酶解溫度為70 ℃時(shí),檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力仍有59.5%。同時(shí),對(duì)轉(zhuǎn)化酶的粗提物在不同溫度下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,確定了此酶活力在4 ℃條件下保存240 min,其活力下降了55.1%,在20 ℃條件下保存240 min,其活力僅下降了39.5%。因此,本研究的檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶具有良好的耐熱性,且采用酶解溫度60 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。何玉蘭等[27]對(duì)黑曲霉重組酸性果膠裂解酶進(jìn)行研究,該酶在30～50 ℃能保持80%以上的相對(duì)酶活,最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

表4 酶解溫度對(duì)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力的影響Table 4 Effects of different enzymolysis temperatures on the activity of limonin debitrase

2.3.2 檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶最適酶解pH值的研究

一般情況下,真菌產(chǎn)柚苷酶的最適pH值在3.0～6.0[28]。不適宜的pH值會(huì)對(duì)酶蛋白的構(gòu)象造成影響,從而使酶活降低。

由表5可知,菌株UA13在酶解pH 2.0～8.0的酶解環(huán)境下,酶活力呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。在酶解pH 5.0時(shí),酶活力最高可達(dá)21.33 U/mL;pH 3.0時(shí)相對(duì)酶活力有90.6%;pH 7.0時(shí)相對(duì)酶活力有81.1%。且實(shí)驗(yàn)可知此酶在pH 3.0～5.0穩(wěn)定性良好,在pH 3.0環(huán)境下仍能保留61.2%的活力。因此,此酶具有良好的耐酸性,能較好地適用于柑橘果汁加工業(yè)。彭程等[29]研究了黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的特性,該酶在pH 3.0～8.0具有良好的活力,且最適酶解pH值也為5.0。

表5 不同酶解pH值對(duì)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶活力的影響Table 5 Effects of different enzymolysis temperatures on the activity of limonin debitrase

2.4 底物親和性研究

測(cè)定本實(shí)驗(yàn)室的檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶粗酶液在不同底物濃度下的反應(yīng)速率,利用Linewear-Burk曲線得出相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬苦素誘導(dǎo)后的菌株發(fā)酵產(chǎn)酶催化3種不同底物(檸檬苦素、橙皮苷、柚皮苷)的反應(yīng)皆符合米氏動(dòng)力學(xué)規(guī)律(圖6)。

圖6 檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶催化不同底物的Linewear-Burk曲線Fig.6 Linewear-Burk curves of different substrates catalyzed by limonin debitrase

實(shí)驗(yàn)可知,底物為檸檬苦素時(shí),Km=0.622 mmol/L,Vmax=0.017 mmol/(L·min);底物為橙皮苷時(shí),Km=0.967 mmol/L,Vmax=0.010 mmol/(L·min);底物為柚皮苷時(shí),Km=0.999 mmol/L,Vmax=0.018 mmol/(L·min)。此粗酶液具有水解檸檬苦素、橙皮苷、柚皮苷的能力,且水解的動(dòng)態(tài)規(guī)律符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。由Km值可知此粗酶液對(duì)底物親和性大小為檸檬苦素>橙皮苷>柚皮苷。因此,此酶對(duì)檸檬苦素的親和性優(yōu)于柚皮苷,這可能是由于檸檬苦素在菌株生長(zhǎng)中作為誘導(dǎo)物兼碳源導(dǎo)致的結(jié)果。

大多數(shù)脫苦酶對(duì)柚皮苷有著更高的底物親和性[30-31]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究以柚皮苷為誘導(dǎo)物對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),探究酶對(duì)底物親和性的大小,發(fā)現(xiàn)柚皮苷誘導(dǎo)后的酶對(duì)柚皮苷親和性更高(Km=0.480 mmol/L),對(duì)檸檬苦素的底物親和性較差(Km=91.920 mmol/L)。因此,可以推斷誘導(dǎo)物的不同對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)酶有著很大的影響,經(jīng)長(zhǎng)期誘導(dǎo)和優(yōu)化后的菌株對(duì)相應(yīng)的誘導(dǎo)物的底物親和性會(huì)更好,酶解相應(yīng)的苦味物質(zhì)能力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn),確定菌株UA13發(fā)酵產(chǎn)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的最適種齡、接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵液的初始pH值。在此基礎(chǔ)上,對(duì)菌株進(jìn)行了1 L 發(fā)酵罐優(yōu)化試驗(yàn),確定菌株更適宜在250 r/min、30 ℃、pH 5.0環(huán)境下生長(zhǎng),酶活力最高可達(dá)48.52 U/mL,相較于優(yōu)化前提高318.3%,且縮短了發(fā)酵周期,為檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的工業(yè)化量產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶的性質(zhì)和底物親和性進(jìn)行研究,結(jié)果表明此酶可同時(shí)酶解柑橘加工中的兩種苦味物質(zhì)(檸檬苦素、柚皮苷),對(duì)兩者的底物親和性都較好,這是目前大多數(shù)轉(zhuǎn)化酶所不具備的。同時(shí)檸檬苦素轉(zhuǎn)化酶具有較好的耐熱性和耐酸性,能夠更好的適用于柑橘加工業(yè),具有較好的商業(yè)價(jià)值。