全腦缺血再灌注大鼠海馬Ｃａｓｐａｓｅ－３、８表達(dá)及ＨＷＴＸ－Ｉ神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究

劉仁儀　陳嘉勤　毛海峰　王一蓉

（1.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410012；2. 湘南學(xué)院公共課部，湖南 郴州 423000；

3.宜春學(xué)院體育學(xué)院，江西 宜春 336000；4.湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

摘 要：為觀察虎紋捕鳥(niǎo)蜘蛛毒素-I(HWTX-I)對(duì)全腦缺血再灌注大鼠海馬組織凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表達(dá)的影響。將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組及用藥組；采用改良的Pulsinelli“四血管阻斷”法制備全腦缺血損傷模型并結(jié)合蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-8mRNA 表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，HWTX-I能顯著降低全腦缺血再灌注大鼠海馬組織CA1區(qū)Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表達(dá)( P <0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示, HWTX-I能顯著降低全腦缺血及再灌注大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-8核酸水平的表達(dá)( P <0.05)。提示：HWTX-I蛛網(wǎng)膜下腔用藥對(duì)全腦缺血再灌注SD大鼠海馬組織的保護(hù)作用可能通過(guò)抑制凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：虎紋蜘蛛毒素-I；腦缺血再灌注；海馬；半胱天冬酶-3；半胱天冬酶-8

中圖分類號(hào)：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)10-1368-04

The Expression of Caspase-3,8 in the Hippocampus of Rat in Global Cerebral Ischemia and

Reperfusion and the Mechanism of Neural Protection with HWTX-I

LIU Ren-yi1,2, CHEN Jia-qin1, MAO Hai-feng3, WANG Yi-rong4,1

(1. College of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan China; 2. Department of Common Curricula,

Xiangnan College, Chenzhou 423000, unan China; 3.Yichun College, Yichun 336000 Jiangxi China;

4.Hunan Physical Education Academy, Changsha 410008, Hunan China)

Abstract:To investigate the effects of Huwentoxin-I (HWTX-I) on expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors, such as Caspase-3, Caspase-8 in hippocampus tissue, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats. 48 female SD rats randomly are divided into the sham-operation group, the physiological saline group and administration group, and each group consisted of 18 rats. the improved global cerebral ischemia damage models of Pulsinelli 4-blood vessal occlusion combined with the method of inserting anaesthesic tube into intrathecal space are adopted to detect the changes of the expression of Caspase-3 and Caspase-8, in protein by immunohistochemistry, and mRNA by RT-PCR. Immunohistochemical staining indicates that HWTX-I can lighten strong positive expression of Caspase-8 and Caspase-3 in hippocampal CA1 region, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats ( P <0.05), and the expression of Caspase-8 and Caspase-3mRNA in the hippocampus tissue of administration group( P <0.05). It can be concluded that, injected into intrathecal space, HWTX-I tends to have anti-apoptotic role in the hippocampus tissues of rats subjected to transient ischemia,through inhibiting the expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors Caspase-3 and Caspase-8.

Key words: HWTX-I; cerebral ischemia and reperfusion; hippocampus; Caspase-3(p20); Caspase-8(p10)

虎紋毒素-I（HWTX-I）是從我國(guó)珍稀蜘蛛虎紋捕鳥(niǎo)蛛（Selenocosmia huwena）粗毒中分離純化的一種天然多肽類神經(jīng)毒素，能可逆地阻斷小鼠膈神經(jīng)－膈肌的神經(jīng)傳導(dǎo)，是一種作用于突觸前膜的N型鈣離子通道阻斷劑^[1]，探討HWTX-I在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，無(wú)疑具有重要的意義。目前本校已經(jīng)完成HWTX-I作為國(guó)家I類鎮(zhèn)痛新藥開(kāi)發(fā)的臨床前實(shí)驗(yàn)，即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)。HWTX-I分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)作用和鎮(zhèn)痛效應(yīng)與美國(guó)Neurex公司開(kāi)發(fā)的新型多肽鎮(zhèn)痛藥芋螺毒素(ω-conotoxin，MVIA)相似^[2]，研究證實(shí)，芋螺毒素同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用^[3]。在我們前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HWTX-I具有抗大鼠腦缺血損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的跡象。大鼠海馬CA1區(qū)是腦缺血損傷敏感區(qū)和易損區(qū),我們通過(guò)觀察HWTX-I對(duì)全腦缺血再灌注大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-8凋亡相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探測(cè)HWTX-I對(duì)腦缺血損傷海馬組織保護(hù)作用的有效性和可能分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)一種新型的神經(jīng)保護(hù)作用藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

虎紋鎮(zhèn)痛肽（HWTX-I）白色凍干粉針0.4 mg/西林瓶，由湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)研究室分離純化，深圳科興生物制品公司制藥廠加工成凍干粉針，批號(hào):000418，通過(guò)質(zhì)譜和高效液相以及小鼠膈神經(jīng)阻斷實(shí)驗(yàn)鑒定，純度≥96％，應(yīng)用劑量1.0 μg/kg。5～6周齡健康雄性SD大鼠48只，體重180～250 g，由湖南省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。免疫組化A、B、C試劑、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Caspase-3一抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Caspase-8一抗購(gòu)自CellSience。上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成Caspase-3、Caspase-8及GAPDH引物。此外包括PCR試劑、抽提總RNA試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑等。主要儀器：PCR儀（eppendorf,德國(guó)），旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（HM3401型,德國(guó)MICROM），凝膠成象分析系統(tǒng)（GIS-1000型,Tanon）,專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（SimplePCI,美國(guó)）。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 ┆48只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、生理鹽水組、用藥組，每組16只，其中每組有8只進(jìn)行Caspase-3、Caspase-8免疫組化檢測(cè)，另8只用于做RT-PCR檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建 具體過(guò)程如下：根據(jù)Pulsinelli^[4]“四血管閉塞”全腦缺血再灌注損傷模型結(jié)合Yaksh TL等^[5]蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù)，經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)建立該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。具體操作過(guò)程如下：

10％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g體重），于枕骨下沿背正中線切開(kāi)約1.5 cm長(zhǎng)口子，暴露第一頸椎，找到后弓上的翼突孔，用灼熱的電烙鐵尖頭將孔內(nèi)的椎動(dòng)脈燒斷。隨即進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管：暴露寰枕后膜，在蛛網(wǎng)膜上小心地勾破出一小孔，插入PE10管（聚乙烯管，外徑0.61 mm，內(nèi)徑0.28 mm，美國(guó)進(jìn)口）至蛛網(wǎng)膜下腔，插入深度為2 cm，外端約留5 cm長(zhǎng)到達(dá)脊髓腰膨大水平處，在管開(kāi)口端預(yù)先用封口膜纏一小結(jié)球以確定插入深度，縫合小球固定在頸背肌上。熱封閉暴露在外的PE-10管口以防感染，埋管，縫合切口。上述手術(shù)24 h后，進(jìn)行頸總動(dòng)脈夾閉：10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g鼠體重），大鼠仰臥于手術(shù)板上，剪去頸前部鼠毛，絡(luò)合碘消毒，在兩前肢直線上方沿腹正中線切開(kāi)2 cm長(zhǎng)皮膚口子，分離皮下脂肪、筋膜、肌肉直至大鼠氣管，注意勿傷及氣管，否則易引起喉部及氣管水腫，導(dǎo)致大鼠迅速窒息，用玻璃分針于氣管兩側(cè)下方分離頸總動(dòng)脈，微型無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，10 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，縫合傷口，手術(shù)區(qū)域涂絡(luò)合碘消毒，術(shù)后肌肉注射20萬(wàn)單位青霉素鈉消炎。

1.3 給藥方法 假手術(shù)組僅切開(kāi)組織和皮膚，但不夾閉不給藥。HWTX-I組于夾閉后立即給藥，分別按1.0 μg/kg劑量給藥，給藥時(shí)用微量注射器將藥物直接注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，隨后再注入10 μL生理鹽水沖洗封閉PE10管。生理鹽水組于夾閉后注入等量生理鹽水。HWTX-I組與生理鹽水組大鼠缺血再灌注3 d，每日注射1次，至第4日處死取材。

1.4 取材和切片 ┆大鼠再灌注72 h后,經(jīng)腹腔注射10％水合氯醛（0.3 mL/100 g體重）麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)腹壁，暴露隔肌，小心剪開(kāi)隔肌，暴露心臟。用灌流穿刺針經(jīng)心尖部刺入左心室沿心臟縱軸方向至主動(dòng)脈根部，止血鉗固定灌流穿刺針。之后在右心耳處剪一小口將血液放出。用約100 mL 0.9%生理鹽水灌流，待右心耳流出液變清亮?xí)r，再用4％多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1M，pH＝7.4）200～250 mL灌流，一般灌流時(shí)間不少于20 min。灌流結(jié)束后取出腦組織標(biāo)本，固定于4％多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1M，pH＝7.4）中12 h以上，然后石蠟包埋，進(jìn)行組織切片，組織切片厚為5 μm，每一載玻片約3～4張切片。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.5.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟 石蠟切片,常規(guī)脫蠟復(fù)水后于3 %H²O²去離子水孵育8 min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；加熱進(jìn)行抗原修復(fù)10 min；正常羊血清室溫下孵育12 min,傾去，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（溶劑為PBS，兩者的比例為1：100），4℃ 過(guò)夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加試劑B，37℃下孵育15 min ；PBS沖洗，5 min×3次；滴加試劑C，37℃下孵育15 min；PBS沖洗，5 min×3次； DAB 顯色劑顯色，終止反應(yīng)后, 蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，并且在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色圖像的處理與分析 用SimplePCI圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化測(cè)試區(qū)的平均灰度級(jí)、陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度與面積、背景面積進(jìn)行測(cè)量，并且計(jì)算陽(yáng)性單位PU，計(jì)算公式為PU=100×|Gα-GA|／［(1-n／m+n)×Gmax］^[6]，其中GA為測(cè)試區(qū)A的平均灰度級(jí)；Gα為陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物α相的平均灰度級(jí)；n為陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的面積；m為背景面積；Gmax為測(cè)試儀器的最大灰度分級(jí)。

1.6 總RNA抽提與RT-PCR檢測(cè)

1.6.1 總RNA的抽提 斷頸處死大鼠，在無(wú)菌操作條件下取出右半球海馬，放入已消毒處理過(guò)的EP管內(nèi)，手動(dòng)勻漿，加1 mL Trizol 于勻漿器中，用移液槍反復(fù)抽吸搗碎組織，振蕩混勻；加200 μL氯仿，振蕩混勻；4℃，12 000 rpm離心10 min，取上清液，后加500 μL異丙醇，-20℃保存1 h以上；4℃，12 000 rpm離心15 min，去上清，再用80%乙醇洗滌，靜置片刻；4℃，12 000 rpm離心5 min，去上清，EP管口朝上干燥20 min以上便于乙醇揮發(fā)，再按沉淀的多少酌情加入DEPC水溶解，振蕩混勻。

1.6.2 RT-PCR操作步驟

1.6.2.1 反轉(zhuǎn)錄 總反應(yīng)體系為20 μL。取10 μL RNA于72℃變性2 min，后冰浴2 min，再在EP管內(nèi)分別加入4 μL Mgcl²、2 μL 10×Buffer、2 μL dNTP、0.5 μL inhibitor、1 μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶和1μl Oligo primer，此操作均在冰桶內(nèi)進(jìn)行。再將裝有上述混合液的EP管放入恒溫箱內(nèi)，條件設(shè)定為：42℃，90 min；99℃，5 min 。然后-20℃保存，獲得cDNA的第一鏈。

1.6.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Caspase-3、Caspase-8引物合成序列分述如下：Caspase-3上下游引物分別為5′-caatggtaccgatgtcgatg -3和5′- gacccgtcccttgaatttct -3，產(chǎn)物大小為447 bp；Caspase-8上下游引物分別為5′-ggaaggatcgacgattacga -3′和5′- cccttgtccccatgtgatag -3′,產(chǎn)物大小為452 bp；內(nèi)參照GAPDH上下游引物分別為 5′-tcaccatcttccaggagcgag-3′和5′-tgtcgctgttgaagtcagag-3′，產(chǎn)物大小為697 bp。

總反應(yīng)體系為20 μL。往20 μL EP管加80 μL無(wú)菌水，稀釋至100 μL，作為cDNA模板；取1 μL cDNA模板，分別加入5×Buffer 4 μL，2.5 mM dNTP 0.25 μL，GAPDH3' 0.5 μL，GAPDH5' 0.5 μL，Caspase-3（或Caspase-8）上下游引物分別為1 μL，Taq酶0.125 μL，無(wú)菌水11.5 μL。此操作均在冰桶內(nèi)進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)：94℃，5 min；94℃，45 s；60℃，45 s；72℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.6.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照。

1.6.3 圖像處理與分析 用SimplePCI圖像分析軟件對(duì)看家基因GAPDH和目的基因表達(dá)電泳條帶的灰度值和面積進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算比值R，R為同一組內(nèi)目的基因表達(dá)電泳條帶的灰度值g與面積值a的乘積比上看家基因表達(dá)的條帶灰度值G與面積A乘積的值，即R=g×a/(G×A)，其中g(shù)、a、G、A為同一組別的測(cè)量值，R值的大小反映目的基因表達(dá)的強(qiáng)弱。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 假手術(shù)組、生理鹽水組和用藥組分別以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ X±S ）表示各定量指標(biāo)平均值和離散程度，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，樣本均數(shù)的比較采用成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析， P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P <0.01為差異具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

2.1.1 免疫組化定性實(shí)驗(yàn) 從圖1-I、II中，我們可以觀察到：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)幾乎未見(jiàn)Caspase-3、Caspase-8表達(dá)（黃色為Caspase-3、 Caspase-8的陽(yáng)性表達(dá)）；生理鹽水組海馬CA1區(qū)出現(xiàn)較強(qiáng)的Caspase-3、Caspase-8表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多；用藥組海馬CA1區(qū)有次強(qiáng)的Caspase-3、 Caspase-8表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞分布明顯較生理鹽水組少而稀疏。

I Caspase-3蛋白表達(dá) II Caspase-8蛋白表達(dá)

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)定位A

（×16），B、C（×160）

注：圖1-I、II中的A、B、C分別為假手術(shù)組、生理鹽水組和用藥組。2.1.2 免疫組化半定量實(shí)驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表1）：Caspase-3、Caspase-8陽(yáng)性單位值以生理鹽水組為高，用藥組和假術(shù)組與隨之降低；假手術(shù)組Caspase-3、Caspase-8表達(dá)與生理鹽水組比較，差異具有非常顯著性意義（ P <0.01）；生理鹽水組Caspase-3、Caspase-8表達(dá)與用藥組比較，差異具有顯著性意義（ P <0.05）；HWTX-I具有較明顯降低缺血再灌注大鼠海馬Caspase-3 、Caspase-8表達(dá)的作用。

2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 在圖2-I中每條泳道中，600 bp～700 bp之間可見(jiàn)GAPDH表達(dá)的條帶G，產(chǎn)物大小為697 bp，在400 bp～500 bp之間分別可見(jiàn)假手術(shù)組、生理鹽水組、用藥組Caspase-3mRNA擴(kuò)增出來(lái)的cDNA條帶A、B、C，產(chǎn)物大小為447 bp；在圖2-II中每條泳道中，600 bp～700 bp之間可見(jiàn)表達(dá)的GAPDH條帶G，產(chǎn)物大小為697 bp，在400 bp～500 bp之間分別可見(jiàn)假手術(shù)組、生理鹽水組、用藥組Caspase8 mRNA擴(kuò)增出來(lái)的cDNA條帶A、B、C，產(chǎn)物大小為452 bp；假手術(shù)組也存在Caspase-3、Caspase-8mRNA表達(dá)。

2.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 在大鼠海馬CA1區(qū)通過(guò)SimplePCI圖像分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果顯示：假手術(shù)組Caspase-3表達(dá)量與生理鹽水組比較，差異具有非常顯著性意義( P <0.01)；用藥組Caspase-3表達(dá)與生理鹽水組比較，差異具有顯著性意義( P <0.05)。假手術(shù)組Caspase-8表達(dá)量與生理鹽水組比較，差異具有顯著性意義( P <0.05)；用藥組Caspase-8與生理鹽水組表達(dá)比較差異具有顯著性意義( P <0.05)。HWTX-I具有較明顯降低缺血再灌注大鼠海馬Caspase-3 、Caspase-8表達(dá)的作用(表2)。

3 分析與討論

腦缺血時(shí)，胞內(nèi)鈣急劇增高可能來(lái)自兩個(gè)方面:胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣釋放，其中胞外Ca²⁺內(nèi)流可能主要通過(guò)細(xì)胞膜上的兩種通道完成的:一個(gè)是由能量衰竭造成的電壓門(mén)控鈣通道開(kāi)放,另一個(gè)是由興奮性氨基酸在細(xì)胞外堆積激活谷氨酸受體造成的受體門(mén)控鈣通道開(kāi)放。Werling^[7]證實(shí)，腦缺血時(shí)，電壓依賴性通道開(kāi)放時(shí)間延長(zhǎng),Ca²⁺內(nèi)流增加，然而也有學(xué)者^[8]認(rèn)為細(xì)胞膜鈣通道對(duì)腦缺血胞內(nèi)鈣積聚不起主要作用。Ca²⁺超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的“最后共同通路”^[9]。 Greenberg^[10]和Lysko^[11]的實(shí)驗(yàn)證明缺血后腦組織鈣離子的聚積與組織損害、腦水腫程度一致。

胞內(nèi)鈣超載將激活一些凋亡因子的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)性腦缺血的在體大量研究證實(shí)Caspase-3介導(dǎo)腦缺血凋亡的過(guò)程，腦缺血后不僅Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),而且其蛋白酶活性也有所改變，短暫全腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)與Caspase-3活性呈顯著正相關(guān)。Ni^[12]等發(fā)現(xiàn)大鼠短暫性全腦缺血后,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元可見(jiàn)Caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào), 在缺血24 h其上調(diào)最顯著,這種高水平的表達(dá),可持續(xù)72 h,而到缺血96 h后,則顯著下降。Caspase-3的激活可以通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的和細(xì)胞內(nèi)線粒體介導(dǎo)的兩條途徑, 兩條途徑分別活化Caspase-8和Caspase-9，繼而激活Caspase-3后引發(fā)Caspase蛋白水解級(jí)聯(lián)的“瀑布效應(yīng)”。活化的Caspase-3可通過(guò)水解特異性蛋白底物從多方面促進(jìn)凋亡的發(fā)生，如對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白及看家蛋白的水解,促使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，而對(duì)DNA裂解酶的抑制蛋白的水解，使DNA裂解酶活化，直接導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡；另一方面Caspase-3水解并滅活DNA修復(fù)酶阻止DNA修復(fù)。因此，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵性效應(yīng)酶參與腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而Caspase-8則是介導(dǎo)于死亡受體凋亡通路重要的蛋白酶。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白有少量表達(dá)，說(shuō)明在非應(yīng)激狀態(tài)下海馬組織就有Caspase-3、Caspase-8基因的少量表達(dá),這可能與保持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定性，防止基因突變發(fā)生有關(guān)。用藥組Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表達(dá)明顯比生理鹽水組低，因而HWTX-I具有較明顯降低缺血再灌注大鼠海馬組織凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表達(dá)的作用，這提示HWTX-I具有抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞凋亡的一個(gè)基本特征，結(jié)合我們的前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠海馬組織切片經(jīng)過(guò)Nissl染色后在光鏡下觀察，生理鹽水組和假手術(shù)組及用藥組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元有著不同的形態(tài)學(xué)變化，其中假手術(shù)組可見(jiàn)數(shù)層錐體神經(jīng)元，排列整齊緊密。用藥組錐體神經(jīng)元，排列較整齊，略為疏散分布，而生理鹽水組錐體神經(jīng)元排列散亂，層次不完整，稀疏分布；在超微結(jié)構(gòu)方面也有著不同的變化，電鏡觀察結(jié)果顯示生理鹽水組線粒體嵴模糊不清，出現(xiàn)空泡化等破壞現(xiàn)象，假手術(shù)組及用藥組大鼠海馬細(xì)胞的線粒體嵴清晰可見(jiàn)。因此，從形態(tài)學(xué)上的觀察結(jié)果來(lái)看，HWTX-I對(duì)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)組織也具有神經(jīng)保護(hù)作用。我們推測(cè)腦缺血后其神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制是通過(guò)HWTX-I作用于突觸前膜的N型鈣離子通道，在一定程度上有效阻礙胞外鈣離子的內(nèi)流，從而抑制了由于胞內(nèi)鈣離子聚集而激活Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表達(dá)，減輕了海馬組織損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示突觸前N型Ca²⁺通道的激活是腦缺血時(shí)鈣離子內(nèi)流的一個(gè)重要的原因，死亡受體凋亡通路可能在腦缺血損傷中被激動(dòng)活,通過(guò)此類鈣拮抗劑的應(yīng)用能夠達(dá)到很好的腦缺血損傷治療作用。本實(shí)驗(yàn)顯示隨著HWTX-I神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的深入研究，HWTX-I可望成為臨床治療缺血性刺激引起顱腦損傷的有效藥物,在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有可能具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

HWTX-I蛛網(wǎng)膜下腔用藥對(duì)全腦缺血及再灌注SD大鼠海馬組織的保護(hù)作用可能通過(guò)抑制凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Pen K,Chen XD, Liang SP, et al. The effect of Huwentoxin-1 on channels in differential NG108-15 cells, a patch-clamp study. Toxicon,2001,39 (4):491-8.

［2］ Qu,Y.X,Liang, S.P,Ding, J.H et al.Proton nulclear magnetic resonance studies on huwentoxin-I from the venom of the spider Selenocosmia huwena:2,three-dimensional structure in solution. J.Prot.Chem, 1997,16(6):565-74.

［3］ Valentino K, Newcomb R, Gadbois T, et al. A selective N-type calcium channel antagonist protects against neuronal loss after global cerebral ischemia.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:7894.

［4］ Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemic in the unanesthetized rat. Stroke,1979,10(3):267-72.

［5］ Yaksh TL, Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav,1976,17(5): 1031-6.

［6］ 申洪.免疫組織化學(xué)染色定量方法研究［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,1995,4(1):89-92.

［7］ Werling LL, Hoehner PJ, Hurt KJ, et al. Increased activation of L-typevoltage-dependent calcium channels is associated with glycine enhancement of N-methy l-D-aspartate stimulated dopamine release in global cerebral ischemia /reperfusion. J Neurochem,1994,63(1):215-21.

［8］ Lazarewicz JW, Pluta R, Puka M, et al. Local nimodipine application improves early functional recovery In the rabbit hippocampus. Acta Neurobiol Exp,1993,53:499-510.

［9］ Morley P, Hohan MJ, Hakim AM. Calcium-mediated mechanisms of ischemic injury and protection. Brain Pathol,1994,4(3):37-47.

［10］ Greeberg JH, Uematsu PD, Araki N, et al. Cytosolic free calcium during focal ischemia and the effects of nimodipine on calcium and histologic damage. Stroke ,1990,21(12suppl):72-4.

［11］ Lysko PG, Lysko KA,Webb CL, et al. Neuroprotective effects of carvediol,a new antihypertensive,at the N-methyl-D-aspar-tate receptor. Neurosci Lett,1992,148:34.

［12］ Ni B,Wu X,Su Y,et al.Transient global forebrain ischemia induces A prolonged expression of the Caspase-3 mRNA in rat hippocampal CA1pyramidal neurons.J Cereb Blood Flow Metab,1998,18(3):248-256.