間歇性負重游泳訓練對大鼠杏仁基底外側核（ＢＬＡ）ｃ－ｆｏｓ蛋白表達的影響

于　芳　張安民　王根深　汪曉陽

（1.中北大學運動人體科學實驗中心，山西 太原 030051；2. 煙臺大學體育學院，山東 煙臺 264005；3.山西大學體育學院，山西 太原 030006）

摘 要：目的：觀察間歇性負重游泳訓練后大鼠杏仁基底外側核（BLA）內c-fos蛋白表達的變化，探討間歇性游泳訓練對c-fos蛋白表達的誘導機制。方法：建立大鼠間歇性負重游泳訓練模型，用ABC免疫組織化學方法檢測訓練后即刻、0.5、1 h、2 h、4 h大鼠BLA 內c-fos蛋白表達狀況，并通過圖像分析系統(tǒng)和統(tǒng)計學軟件進行圖像和數(shù)據分析。結果：對照組大鼠BLA 內c-fos陽性神經元少量散在分布；模型組明顯增多，且隨著時間的增長呈上升趨勢（0.5 h＜1 h＜2 h），2 h達到峰值，與對照組相比具有非常顯著性差異（ P ＜0.01）；然后逐漸下降。結論：間歇性負重游泳訓練可引起大鼠BLA中c-fos蛋白表達上調，且具有一定的時效性，其機制可能與間歇運動能引起神經細胞內鈣離子濃度變化有關。

關鍵詞：間歇訓練；杏仁基底外側核；c-fos蛋白；大鼠

中圖分類號：G804.5文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)10-1357-04

The Influence of Intermittent Swimming Exercise on the Expression of C-fos Protein in

Basolateral Nucleus of Rat Amygdale

YU Fang1, ZHANG An-ming2, WANG Geng-shen3, WANG Xiao-yang3

（1. Kinesiology Experiment Center, North University of China, Taiyuan 030051, Shanxi China; 2.College of Physical Education,

Yantai University, Yantai 264005,Shandong China; 3.College of Physical Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi China）

Abstract:Objective To investigate the mechanism of the expression of c-fos protein by observing the changing tendency of c-fos protein in basolateral nucleus of rat amygdale (BLA) after intermittent swimming exercise. Methods: To establish the intermittent swimming exercise models, and detect the expression of c-fos protein in BLA at the moments of 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h after exercise by immunohistochemical SABC method, then analyze the image and data by image analyzing system and statistic software. Results: Several Fos+ neurons of control group distribute in the BLA dispersively while the swimming groups express significantly higher, and increases progressively with time (0.5 h＜1 h＜2 h), the peak of Fos+ neurons happened at 2 h, and appears significant difference as compared with the control group ( P ＜0.01); then descends regularly. Conclusion: Intermittent swimming exercise raises the expression of c-fos protein in BLA，and has a certain timeliness. The mechanism has deal with the change of the intracellular calcium concentration at nerve cells.

Key words: intermittent exercise; basolateral nucleus of amygdale (BLA); c-fos protein; rat

大量研究表明，長期適宜運動訓練可有效避免或延緩由于衰老而出現(xiàn)的神經系統(tǒng)各種癥狀和功能的退行性變化，促進神經元的再生^[1～3]，還可誘導許多與神經活性、突觸結構、神經可塑性等相關基因表達，有利于神經的生長、調節(jié)及保護，并對大腦皮層形態(tài)結構產生良好的影響，從而提高學習和記憶能力^[4～7]。有學者認為，c-fos原癌基因參與了神經的生化和結構的長久變化，而這些變化是學習和記憶的基礎^[8]。c-fos原癌基因又稱快反應基因或即刻早期基因，其特點是對細胞外刺激的快速誘導性，被認為是研究中樞神經系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因^[9～10]，且其表達產物mRNA和核磷蛋白(P55c-fos ,簡稱Fos)位于神經元的胞漿或胞核內，是神經元興奮水平的客觀指標，人們常將其視作神經活性的轉錄因子和標志^[11]。應激、針刺或給予神經肽等不同生理、心理刺激均可誘導c-fos的表達^[12]。

運動作為一種特殊的應激源對c-fos蛋白表達有著顯著的影響。近幾年已有運動訓練時腦內c-fos基因表達變化的報道，但具體到某一神經核團的研究少見。杏仁基底外側核（basolateral amygdala ,BLA）是杏仁核最大的一個核群，分為外側杏仁核、基底核、副基底核。BLA區(qū)含有大量的穿入與傳出纖維，在情緒相關的學習和記憶中發(fā)揮重要作用^[13]。我們采用SABC免疫組織化學的方法檢測c-fos蛋白在大鼠BLA內的表達，來探討間歇訓練后不同時間點BLA內c-fos的表達規(guī)律及其產生機制，為運動訓練及運動康復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）36只，健康3月齡，體重220～250 g。隨機分為對照組（n=6只）、間歇運動組（n=30只）。標準嚙齒類飼料飼養(yǎng)，自由飲水，活動自由。室溫(20±5)℃，濕度45%±10%，光照每天14 ｈ。動物適應環(huán)境3 d，記錄動物體重。

1.2 游泳訓練模型

1.2.1 游泳條件 玻璃鋼游泳池，游泳池規(guī)格為150 cm×70 cm×60 cm，水深60 cm，水溫控制在(34±3)℃。

1.2.2 游泳方案 適應性游泳3 d，每天1次，時間依次為15 min、20 min、30 min，剔除不擅游泳者。隨后開始正式游泳訓練，每周訓練6次，共訓練6周。負重為體重5%，游泳6 min，休息4 min，每天連續(xù)進行10組。對照組不做任何運動，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動。

1.3 取材切片 造模結束后分即刻、0.5 h、1 h、2 h、4 h5個時刻取材。首先用0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物(35～50 mg/kg體重)，打開胸腔，從心尖將穿刺針插入至升主動脈，然后迅速剪破右心耳，并快速灌人400 mL預冷的生理鹽水沖洗血管，隨后用4％多聚甲醛200 mL快速灌注，接著放慢速度仍用4％多聚甲醛300 mL灌注，進行前固定，然后用10％蔗糖PBS灌入300 mL，至肝臟變硬變白為止。最后迅速斷頭，將頭部放在冰盤上，打開顱腔，暴露全腦，取出放在4％多聚甲醛液內固定2 h，再浸入到20％蔗糖PBS液中4℃過夜，待組織塊完全沉底后，用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，隔4取1，片厚40 μm。實驗儀器，采用TD-1508A輪轉式冰凍切片機。

1.4 ABC免疫組織化學染色 兔抗大鼠c-fos多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；即用型SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。冰凍切片經室溫平衡，水化后按以下步驟進行。腦組織切片入0.01 mol/L PBS液中漂洗5 min×3次，3%H²O²孵育10 min；5%封閉液封閉非特異性抗原1 h；加入1：250兔抗c-fos多克隆抗體37℃孵育5 h后4℃過夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃條件下置濕盒內孵育40 min；滴加SABC，37℃孵育30 min；最后DAB顯色20 min。上述步驟間0.01 mol/L PBS液中漂洗5 min×3次。然后置入0.2%明膠中裱片，風干后常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片劑封片。

陰性對照組：分別以正常兔血清和PBS代替第一抗體孵育，對照組未發(fā)現(xiàn)陽性物出現(xiàn)，即無特異性反應。

1.5 圖像分析與統(tǒng)計學處理 ┆采用捷達801形態(tài)圖像分析系統(tǒng)，對大鼠BLA中c-fos陽性神經元進行圖像分析。每例動物取5張切片，在40×10倍光鏡下計數(shù)每張切片雙側BLA中c-fos陽性神經元的數(shù)量。采用SPSS13.0統(tǒng)軟件進行分析，數(shù)據以均值±標準差表示，顯著性檢驗采用獨立樣本 t檢驗，以p <0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

參照模式圖（圖1A、B）定位杏仁基底外側核。光鏡下觀察，6周間歇性負重游泳訓練后，大鼠BLA中c-fos免疫反應陽性神經元呈錐形和卵圓形，多數(shù)為大中型細胞。免疫反應產物呈棕褐色，低倍鏡下為綜色小原點，染色均勻，主要位于神經細胞核內，胞漿內也有部分表達，背底呈淡黃或不著色。圖象分析和統(tǒng)計學處理結果如下（表1，圖2～7）：ゼ湫運動結束后，模型組大鼠BLA中均可見數(shù)量不一的c-fos陽性細胞。正常對照組動物相應部位僅見零星的c-fos蛋白表達。間歇運動后即刻大鼠BLA中c-fos蛋白表達密度小，呈分散型，與對照組相比沒有顯著差異（ P ＞0.05）（圖2、3）；間歇運動后大鼠BLA中c-fos蛋白表達隨時間的延長呈上升趨勢（0.5 h＜1 h＜2 h），2 h時大鼠BLA中c-fos蛋白表達達到峰值，與對照組相比具有非常顯著性差異（ P ＜0.01）（圖4～6）；然后隨時間的延長大鼠BLA中c-fos蛋白表達開始下降，到了4 h時，c-fos蛋白表達明顯減少，但仍然高于對照組，具有顯著性差異（ P ＜0.05）（圖7）。

表1 間歇性游泳訓練后大鼠BLA內c-fos陽性

3 討 論

c-fos原癌基因能迅速對神經遞質、激素、神經沖動等外界刺激引起的傳入信息作出反應，是神經活性的轉錄因子和標志^[11]。在正常情況下，c-fos基因在神經系統(tǒng)的表達很低，參與細胞生長、繁殖、分化、信息傳遞和人的學習、記憶等生理過程。生理性刺激和病理情況下均能短暫地誘導細胞內c-fos基因的表達^[12]。c-fos的轉錄激活在5 min即可發(fā)生，一般維持15～20 min，c-fosmRNA在刺激后30～45 min即可達到高峰。c-fos轉錄產生的成熟mRNA編碼一個由380個氨基酸組成的，相對分子量為6.2×104的核酸蛋白，簡稱Fos，與另一即刻早期基因c-jun的表達產物形成異源二聚體復合物：轉錄因子AP-1（activator protein-1），參與信號傳遞系統(tǒng)中各效應酶的轉錄過程，調節(jié)其他多種基因的靶蛋白合成從而改變神經元的結構和功能^[14]。目前，有人提出至少存在三種模式c-fos蛋白表達：1) 短暫而快速地表達；2) 延遲的持續(xù)性表達；3) 持續(xù)的組織特異性表達^[15]。c-fos表達模式的不同對神經元的作用也具有很大差異，適度c-fos的表達能阻斷細胞內信號的傳導而產生一些死亡因子，細胞凋亡通路中有c-fos表達，表達與DNA損傷及修復有關，并參與細胞周期的調控，具有保護作用，但是不適當?shù)倪^度表達可干預細胞核的修復功能，而導致細胞凋亡^[16～17]。

近年來研究表明，運動作為一種特殊的應激源對c-fos表達有著顯著的影響。跑輪運動和強制性游泳均能增加腦內c-fos基因表達^[18～23]，Taeck-Hyun Lee等的研究發(fā)現(xiàn)，隨著運動強度的增加，c-fos基因表達在大鼠海馬各區(qū)的表達也隨之明顯增強，在第7 d達到最高值，然后又呈現(xiàn)出下降的趨勢，他認為運動能夠時間-強度依賴性的增強海馬神經的活性，而c-fos基因表達繼增加后減少，可能由于腦對應急刺激產生了適應性變化^[19]。Oladehin等研究則顯示，中等強度的有氧運動不僅能維持神經元的活性，而且在運動影響神經系統(tǒng)的過程中起到了調控因子的作用^[23]。其作用機制可能與運動能激活c-fos表達的第二信使有關。目前的研究證實，參與c-fos基因激活的第二信使通路至少有三種：cAMP^[24]、Ca^2+［25]、甘油二脂依賴的蛋白激酶（PKC）^[25]。適宜的運動可以引起腦內突觸前膜多巴胺、5-HT等神經遞質濃度增加^[26]，這些遞質作為細胞間傳遞信息的第一信使，作用于突觸后膜的相關受體上，引起cAMP的產生，c-fos基因就含有cAMP反應序列CRE。另外，運動還可使胞內鈣離子濃度升高，c-fos基因上端調控序列含有鈣反元素（CaRE）轉錄調控元素，可調節(jié)c-fos蛋白表達。那么，極限強度的間歇運動會對大鼠BLA 中c-fos蛋白表達產生怎樣的影響，其誘發(fā)機制可能是什么？正是我們本研究的目的。

杏仁核是邊緣系統(tǒng)中重要的皮質下核團，其結構復雜，纖維聯(lián)系和功能十分廣泛，主要包括三個主要核群，杏仁中央核(CeA)、基底外側核群(BLA)、皮質內側核群(MeA)。其中杏仁基底外側核BLA是杏仁核最大的一個核群（外側杏仁核、基底核、副基底核），含有大量的穿入與傳出纖維，在情緒相關的學習和記憶中發(fā)揮重要作用。杏仁核含有促腎上腺素釋放因子（CRF）^[27]，是參與應激的物質基礎。電生理學研究發(fā)現(xiàn)，給予機體聲音等外界刺激時，杏仁核部位的神經放電活動增強^[28]。C.V. Dayas等研究發(fā)現(xiàn)，給予聲音、免疫性應激刺激均會上調杏仁核部位c-fos基因的表達^[29]。

在本研究中，大鼠經過6周間歇性負重游泳訓練后，大鼠BLA中c-fos蛋白表達在各時間點均大于對照組，除即刻組外，其余各組與對照組均存在顯著性差異( P <0.05)，說明間歇性負重游泳訓練可引起大鼠BLA中c-fos蛋白表達增加。間歇訓練法是一種極限強度并且嚴格控制運動和間歇時間的無氧訓練方法，由于間歇期的存在，幾乎在整個運動期均為最高強度的運動，并且能重復多次，因而在強度和量方面均保持高水平，在供能及生理反應特點上均嚴格區(qū)分于持續(xù)訓練、靜力訓練甚至大強度衰竭性訓練^[30]。我們推測，間歇訓練上調c-fos蛋白表達，可能與胞內鈣離子濃度升高有關。極限強度的間歇運動狀態(tài)下，機體隨著運動血中氧分壓下降而出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，腦缺氧后，突觸前膜的去極化，引起谷氨酸（Glu）釋放入突觸間隙，并與突觸后膜的NMDA受體結合，引起細胞膜上G蛋白構型改變，通過磷脂酶C（PLC）加強磷脂酰肌醇（PI）系統(tǒng)的降解，三磷酸肌醇（IP3）水平上升，作用于細胞內的鈣庫——內質網和線粒體，使胞內鈣離子濃度升高，同時激活高傳導性陽離子通道，引起胞外鈣離子內流，激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC）和蛋白激酶（PKC），然后通過一系列蛋白磷酸化誘導c-fos蛋白表達^[11]。當然，也有研究認為，胞內鈣離子濃度升高時，與鈣調蛋白（CaM）結合形成Ca/CaM復合物，對轉錄因子進行磷酸化修飾，從而啟動c-fos基因的表達^[31]。

另外，在實驗中我們還觀察到，c-fos基因在BLA中的蛋白表達具有很強的時效性。在間歇訓練結束后，大鼠BLA中c-fos蛋白表達隨時間的增加快速升高，2 h時c-fos蛋白表達達到峰值，與對照組相比具有非常顯著性差異（ P ＜0.01）；然后隨時間的延長大鼠BLA中c-fos蛋白表達開始下降，到了4 h時，c-fos蛋白表達明顯減少，但仍然高于對照組，具有顯著性差異（ P ＜0.05）。分析原因：1) 在間歇訓練的刺激下，大鼠BLA中c-fos主要為早期瞬間表達，在訓練后幾小時即快速表達，然后啟動二級結構基因，而自身由于受到次級基因的反饋性抑制的影響，后期表達水平下降；2) c-fos及c-jun基因中存在AP-1結合位點可能起著某種反饋性自我調節(jié)作用；3) 間歇性訓練不同于大強度衰竭性訓練，盡管強度接近極限，但由于間歇期的存在，當一定程度的短暫缺血、缺氧刺激還不至于對大腦形成損傷時，缺血、缺氧所導致的代償作用已經形成，而在每兩次訓練的有限間歇時間內 ，已形成的代償作用尚繼續(xù)保持甚至不斷加強，直到下一次訓練開始。因此，不會象大強度衰竭性訓練那樣使大鼠BLA中神經元內Ca²⁺濃度過度升高，導致鈣超載^[32]，引起c-fos基因的過度表達。

綜上所述，間歇運動可引起大鼠杏仁基底外側核c-fos表達發(fā)生改變，且具有一定的規(guī)律性。因此，我們可以根據c-fos在運動后，表達的主要腦區(qū)、不同時間表達強度及基因誘發(fā)蛋白表達情況，從時間上針對相關靶基因進行干預，這對于預防極限強度后的病理損傷具有重要意義。

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