暗紋東方鲀魚精蛋白的純化及抑菌活性研究

張家源 陳舜勝 張洪才

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

魚精蛋白是一種主要存在于魚類精巢組織中的堿性蛋白質(zhì)，分子量較小，具有廣譜抑菌性、降血壓、抑制腫瘤生長和促消化等功能，還可以恢復(fù)肝素的抗凝血作用，是美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的唯一一種逆轉(zhuǎn)心臟或血管手術(shù)后聚陰離子肝素的抗凝血作用的藥物[1-3]。魚精蛋白的抑菌性早在1937年就被McClean等[4]發(fā)現(xiàn)，隨后被人們廣泛研究。由于魚精蛋白的特殊組成，并且具有較好的生物活性，其在食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用前景。

數(shù)據(jù)[5]顯示，膳食鮭魚魚精蛋白可以改善高脂血癥、動脈粥樣硬化和肥胖癥等癥狀。但魚精蛋白的來源有限，大多從鯡魚和鮭魚等魚類中分離提取，而中國鯡魚和鮭魚的產(chǎn)量并不高。此外，不同種類的魚精蛋白對菌種的抑制效果也存在一定差異。律海倫等[6]采用離子交換層析法對粗粉紅馬哈魚魚精蛋白進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)具有較好的抑菌效果，但未涉及其對革蘭氏陰性菌的抑菌效果研究。曹文紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，中巨石斑魚魚精蛋白對枯草芽孢桿菌的抑菌活性較大腸桿菌顯著。劉淑集等[8]對菊黃東方鲀魚精蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下提取率為19.07%，但并未探究其抑菌活性。目前，鮮有報道河鲀魚精蛋白的純化方法及抑菌活性。因此，為獲得純度高和活性好的暗紋東方鲀魚精蛋白，試驗擬采用葡聚糖凝膠層析和羧甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析對該精蛋白進(jìn)行純化，并通過測定其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度、抑菌圈直徑以及菌種的生長曲線來探究暗紋東方鲀魚精蛋白的抑菌效果，旨在為暗紋東方鲀魚精蛋白的高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗紋東方鲀魚精蛋白：上海海洋大學(xué)食品學(xué)院實驗室自制(暗紋東方鲀精巢由江蘇中洋集團(tuán)股份有限公司提供)；

葡聚糖凝膠G-50(Sephadex G-50)：美國GE Health公司；

羥甲基瓊脂糖凝膠FF(CM Sepharose Fast Flow)、透析袋：上海源葉生物有限公司；

Real Band蛋白預(yù)染Marker：Bio Basic Inc (BBI)；

SDS-PAGE預(yù)制膠(4%～20%)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

三氟乙酸、鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外檢測儀：HD-3型，上海滬西儀器廠有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)：FJ-200型，上海標(biāo)本模型廠；

立式高速冷凍離心機(jī)：GL-26M/MI型，上海趙迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 暗紋東方鲀魚精蛋白最大紫外吸收峰檢測 為確定暗紋東方鲀魚精蛋白的最大紫外吸收波長，先將暗紋東方鲀魚精蛋白配制成0.1%的溶液，再于波長200～500 nm 下進(jìn)行吸收光譜掃描。

1.3.2 葡聚糖凝膠層析 參照徐明生等[9]的方法，稍作修改。稱取15 g Sephadex G-50，輕輕攪拌，充分溶脹。用25 mmol/L的乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH=5.4)浸泡3次后裝入層析柱(Φ1.1 cm×50 cm)，恒流泵流速為1.0 r/min，調(diào)整紫外檢測記錄儀波長為220 nm，靈敏度0.5，用約2～3個柱體積的乙酸—乙酸鈉緩沖液平衡凝膠柱，待基線平衡后上樣。每3 min收集一管，合并相同組分，坂口反應(yīng)檢測目標(biāo)蛋白。冷凍干燥濃縮。

1.3.3 羧甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析 參照胡曉璐等[10]的方法，稍作修改。羧甲基瓊脂糖凝膠作為填料，先用純水清洗4～5次，以去除填料內(nèi)的酒精，再用50 mmol/L 的甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH=8.0)浸泡2～3次后，將填料裝入層析柱(Φ1.6 cm×35 cm)，用4～5 個柱床體積的甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液平衡柱子，調(diào)整紫外檢測儀波長為220 nm，靈敏度0.5，恒流泵流速3.2 r/min，待基線平穩(wěn)后上樣。用甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH=8.0)配置的0.3～1.8 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，3 min/管，合并相同組分后進(jìn)行坂口反應(yīng)檢測，將目標(biāo)溶液透析脫鹽，冷凍干燥濃縮。

1.3.4 坂口反應(yīng) 取2 mL的離心管，加入0.5 mL待檢測蛋白溶液，再依次加入250 μL 10%氫氧化鈉溶液和50 μL 0.2%α-萘酚，充分混勻，加入50 μL次氯酸鈉溶液，觀察溶液顏色變化，同時取0.5 mL精氨酸溶液(0.01%)，重復(fù)上述操作，作為對照觀察。含有魚精蛋白的溶液會由無色變?yōu)榧t色。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對暗紋東方鲀魚精蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3.6 細(xì)菌生長曲線的測定 取魚精蛋白溶液，分別加入含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的試管中，用無菌水作對照，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，測定600 nm處的吸光值。以O(shè)D600 nm作為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線[11]。

1.3.7 魚精蛋白的最小抑菌濃度(MIC) 采用試管法測定魚精蛋白的最小抑菌濃度。取0.1 mL細(xì)菌量為105～106CFU/mL的各菌懸液，加入到含有1.4 mL液體培養(yǎng)基的試管中，加入不同濃度的魚精蛋白溶液1 mL，混勻。37 ℃ 培養(yǎng)24 h，無菌水做空白對照，測定600 nm處的吸光值。

1.3.8 抑菌圈直徑的測定 用無菌生理鹽水配成一定濃度的菌懸液，細(xì)菌量約為105～106CFU/mL。準(zhǔn)備直徑為5 mm的圓形濾紙片若干，滅菌后用不同濃度的魚精蛋白溶液浸泡15 min，瀝干備用。將滅菌的培養(yǎng)基放入超凈工作臺中冷卻至40～50 ℃后倒入含有0.1 mL的各菌種菌懸液的平板中，每皿約20 mL，與菌懸液充分混勻后冷卻凝固。將制備的濾紙片貼在含菌平板上，每個平板中貼4張濾紙片。無菌水浸泡的濾紙片作為對照組。37 ℃ 培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小[12-13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 暗紋東方鲀魚精蛋白紫外吸收光譜

從圖1可以看出，在波長217，273 nm處各有一個吸收峰且217 nm處的吸收峰較高，主要原因是該蛋白中肽鍵引起的紫外吸收較芳香氨基酸明顯[14]。而且17種氨基酸在220 nm附近均有較大的吸收峰[15]，因此選擇蛋白檢測波長為220 nm。

2.2 暗紋東方鲀魚精蛋白的純化

2.2.1 葡聚糖凝膠層析 根據(jù)魚精蛋白的大致分子量，選擇葡聚糖凝膠——Sephadex G-50作為層析填料，暗紋東方鲀魚精蛋白凝膠層析分析圖譜如圖2所示，圖譜中有兩個蛋白峰，合并相同組分，坂口反應(yīng)檢測目標(biāo)蛋白，結(jié)果表明峰Ⅰ出現(xiàn)紅色顯色反應(yīng)，峰Ⅱ未出現(xiàn)顯色反應(yīng)，因此峰Ⅰ為目標(biāo)峰，它也是葡聚糖凝膠層析的主峰。將目標(biāo)蛋白組分冷凍干燥。

圖1 暗紋東方鲀魚精蛋白紫外吸收光譜圖Figure 1 The UV absorption spectra of Takifugu obscurus protamine

圖2 暗紋東方鲀魚精蛋白葡聚糖凝膠層析圖譜Figure 2 Sephadex G-50 gel chromatography of Takifugu obscurus protamine

2.2.2 羥甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析 魚精蛋白是一種堿性蛋白，所以選擇陽離子交換層析填料——羥甲基瓊脂糖凝膠為離子交換層析填料，暗紋東方鲀魚精蛋白離子交換層析紫外吸收圖譜如圖3。從圖3可以看出，1～20管為穿透峰，不做分析，20～100管是用含0.3～1.8 mol/L的NaCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，出現(xiàn)3個峰，分別命名為峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ，鑒定后發(fā)現(xiàn)峰Ⅰ和峰Ⅱ無顯色反應(yīng)，峰Ⅲ坂口反應(yīng)顯著，因此峰Ⅲ為目標(biāo)蛋白峰。將目標(biāo)蛋白組分冷凍干燥。

2.3 暗紋東方鲀魚精蛋白的鑒定

2.3.1 坂口反應(yīng) 經(jīng)坂口反應(yīng)鑒定，含魚精蛋白的組分呈現(xiàn)紅色，其余為無色。說明葡萄糖凝膠層析圖譜中，峰Ⅰ為目標(biāo)峰；羥甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析圖譜中，峰Ⅲ為目標(biāo)峰。

2.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳 從圖4可以看出，純化后的暗紋東方鲀魚精蛋白仍出現(xiàn)兩個條帶，說明該純化方法并不能很好地將其分離開，但得到的條帶較原條帶細(xì)，顏色較淺且無拖尾現(xiàn)象。

圖3 暗紋東方鲀魚精蛋白羥甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析圖譜Figure 3 CM sepharose fast flow ion exchange chromatography of Takifugu obscurus protamine

M. 蛋白Marker A. 粗魚精蛋白 B. CM Sepharose FF Ⅲ峰

2.4 魚精蛋白溶液對細(xì)菌生長曲線的影響

由圖5～7可知，各組的生長情況均呈現(xiàn)S型，且魚精蛋白溶液處理組較對照組遲滯，始終處于較低水平狀態(tài)，可見其抑菌效果明顯。

2.5 魚精蛋白的最小抑菌濃度

從表1可以看出，魚精蛋白對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為500 mg/L，對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為1 000 mg/L。劉燕妮[16]研究得出鮭魚魚精蛋白對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為250 mg/L，對大腸桿菌的最小抑菌濃度與試驗結(jié)果一致，為1 000 mg/L?？偟膩砜?，魚精蛋白對革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度明顯小于革蘭氏陰性菌?？赡苁怯捎诟锾m氏陽性菌的細(xì)胞壁表面帶有較多的負(fù)電荷具有較強(qiáng)的負(fù)電性，具有正電性的魚精蛋白更容易通過靜電作用擾亂革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，實現(xiàn)抑菌作用[17]。

圖5 暗紋東方鲀魚精蛋白對沙門氏菌生長曲線的影響Figure 5 Effect of Takifugu obscurus protamine solution on the growth curves of Salmonella

圖6 暗紋東方鲀魚精蛋白對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Figure 6 Effect of Takifugu obscurus protamine solution on the growth curves of Staphylococcus aureus

圖7 暗紋東方鲀魚精蛋白對大腸桿菌生長曲線的影響Figure 7 Effect of Takifugu obscurus protamine solution on the growth curves of E. coli

2.6 抑菌圈直徑

抑菌圈直徑>7 mm可判定為有抑菌效果[18]。通過對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌3種細(xì)菌的抑菌圈直徑測定(見表2)發(fā)現(xiàn)，20 mg/mL的魚精蛋白溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為8.9 mm。該蛋白抑菌效果的差異可能是由菌種的細(xì)胞壁組成和構(gòu)造差異引起的。

表1 魚精蛋白的最小抑菌濃度?Table 1 Determination of minimum inhibitory concentration of protamine

? “-”表示無菌體生長；“+”表示有菌體生長。

表2 魚精蛋白的抑菌圈直徑Table 2 Inhibitory ring diameter of protamine

? “-”表示培養(yǎng)基中無抑菌圈產(chǎn)生，濾紙片直徑為5 mm。

3 結(jié)論

采用葡聚糖凝膠層析和羥甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析對粗提的暗紋東方鲀魚精蛋白進(jìn)行純化，然后通過精氨酸特征反應(yīng)確定了羥甲基瓊脂糖凝膠FF離子交換層析的峰Ⅲ為目標(biāo)蛋白峰，收集目標(biāo)蛋白峰，依次進(jìn)行透析除鹽、減壓蒸餾濃縮和冷凍干燥后得目標(biāo)蛋白。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)，純化前后的電泳條帶中，后者的魚精蛋白條帶較純化前細(xì)且無拖尾現(xiàn)象。但未能得到單條帶的蛋白組分，說明純化效果不理想。魚精蛋白對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為500，1 000，1 000 mg/L，可有效延緩金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的生長且對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。但其抑菌機(jī)理與差異有待進(jìn)一步研究。