觀賞百合病毒病原形態(tài)及內(nèi)含體研究

梁巧蘭　魏列新　徐秉良　師桂英　謝忠魁

摘要：通過帶病組織汁液和帶病組織超薄切片負(fù)染電鏡技術(shù)對(duì)侵染觀賞百合的病毒粒子和內(nèi)含體進(jìn)行觀察，證明在表現(xiàn)不同癥狀的5個(gè)品種中存在球狀、短線狀、長線狀、短桿狀4種病毒粒子和晶體狀、風(fēng)輪狀、束狀、卷筒狀、正六邊形5種內(nèi)含體，通過ELISA檢測(cè)及病毒粒子形態(tài)、大小及內(nèi)含體形態(tài)分析，確定球狀病毒粒子(直徑29.5 nm)為黃瓜花葉病毒，短線狀病毒粒子(593.29～639.97 nm×12.15～11.12 nm)為百合無癥病毒，長線狀病毒粒子(757.58～846.25 nm×12.12～12.75 nm)為馬鈴薯Y病毒，短桿狀病毒粒子(500～807.69 nm×153.85～192.31 nm)為煙草脆裂病毒。

關(guān)鍵詞：觀賞百合；病毒病原；形態(tài)；內(nèi)含體

中圖分類號(hào)：S 432．41

百合病毒病是當(dāng)前百合生產(chǎn)中最主要的病害之一。自sterwart(1896)描述百合壞死條紋以來，相繼報(bào)道了百合病毒病原14種，類菌原體1種。其中分布廣危害嚴(yán)重的是百合無癥病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(Cucumber virus,CMV)，郁金香碎錦病毒(Tulip breaking virus，TBV)，百合叢簇病毒(Lily rosette virus，LRV)。病毒侵染后，植株嚴(yán)重矮化，葉片簇生、或卷曲、葉面上出現(xiàn)凸凹不平的泡斑，葉片黃化或呈現(xiàn)花葉狀；莖稈扭曲或呈扁平狀畸形生長；鱗莖變小，產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)60％以上，品種變劣，種質(zhì)明顯退化；開花少且小，有時(shí)花瓣上出現(xiàn)枯斑或者雜色，有的甚至不能開花，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整株枯死，嚴(yán)重影響百合觀賞價(jià)值的發(fā)揮，給百合生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，有關(guān)百合病毒病原的研究國內(nèi)外已有不少報(bào)道，但對(duì)侵染觀賞百合病毒形態(tài)的研究，報(bào)道較少，為此，本文采用ELISA技術(shù)檢測(cè)了侵染觀賞百合的CMV和LSV的發(fā)生情況，并通過病汁液負(fù)染和病組織超薄切片負(fù)染的電鏡技術(shù)對(duì)侵染觀賞百合的病毒粒子和內(nèi)含體的有無及形態(tài)進(jìn)行了觀察。

1材料與方法

1．1供試材料

選用采自臨洮新興花卉基地和榆中亞盛花卉基地觀賞百合病毒病發(fā)生嚴(yán)重，且癥狀表現(xiàn)不同的觀賞百合品種寶佳、西伯利亞、精萃、阿蒂琳娜和熱情為試驗(yàn)材料。其中寶佳癥狀為葉片卷曲，有凸凹不平的泡斑狀花葉；西伯利亞為葉脈綠色、葉肉黃化狀花葉；精萃為深、淺綠相間的斑駁狀花葉；阿蒂琳娜為植株矮化，葉片呈黃綠相間的花葉；熱情為扁莖，葉簇生，莖稈扭曲。

1．2 ELISA檢測(cè)

采用間接ELISA(I-ELISA)和雙抗夾心ELISA(DAS-ELISA)兩種方法分別對(duì)5個(gè)觀賞百合樣品受黃瓜花葉病毒和百合無癥病毒侵染情況進(jìn)行檢測(cè)；黃瓜花葉病毒(CMV)抗血清及酶標(biāo)抗體、百合無癥病毒(LSV)ELISA檢測(cè)試劑盒均為美國Agdia公司產(chǎn)品。

1．3病毒粒子形態(tài)

1．3．1病毒粒子的負(fù)染檢測(cè)

稱取5個(gè)觀賞百合樣品新鮮病葉各1 g，在滅菌冰凍研缽中充分研磨至勻漿，并將勻漿液在4℃下8 000 r／min離心15 min；用毛細(xì)滴管吸取上清液滴于附有Formvar膜(聚乙烯醇縮甲醛)的銅網(wǎng)上，稍待片刻，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體；用3％的磷鎢酸負(fù)染色液染色后，置于JEM-100CX透射電鏡下，觀察病毒粒子形態(tài)，并拍照。

1．3．2組織切片負(fù)染觀察

取5個(gè)觀賞百合樣品的新鮮病葉組織，經(jīng)3％戊二醛和1％四氧化鋨雙固定，乙醇系列脫水后，用Epon812(環(huán)氧樹脂)包埋，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置于JEM-100CX透射電鏡下，觀察病組織中的內(nèi)含體、病毒粒子的有無及其形態(tài)，記錄并拍照。

2結(jié)果與分析

2．1ELISA檢測(cè)

間接ELISA(I－ELlSA)對(duì)5個(gè)樣晶CMV的檢測(cè)結(jié)果表明：5個(gè)觀賞百合樣品中有2個(gè)樣品即寶佳和阿蒂琳娜受CMV侵染，經(jīng)550型酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定各檢測(cè)孔在490 nm處的OD值，代入臨界值(P／N)公式，計(jì)算結(jié)果為寶佳和阿蒂琳娜的P／N分別為2.61和2.20，大于2，為陽性反應(yīng)，CMV的檢出率為40％(表1)。

DAS-ELISA對(duì)5個(gè)樣品LSV的檢測(cè)結(jié)果表明：除熱情外其余4個(gè)觀賞百合樣品均受到LSV的侵染；經(jīng)550型酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定各檢測(cè)孔在410 nm處的OD值，代入臨界值(P／N)公式，計(jì)算結(jié)果為寶佳、西伯利亞、精萃、阿蒂琳娜、熱情的P／N分別為2.236、3.006、2.290、2.960、1.149，除熱情外，其余均大于2，為陽性反應(yīng)，而且西伯利亞和阿蒂琳娜的P／N值大于陽性對(duì)照的P／N，值2.43，LSV的檢出率為80％(表2)。

通過ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5個(gè)觀賞百合樣品中存在CMV和LSV復(fù)合侵染的現(xiàn)象，復(fù)合侵染率為40％。

2．2內(nèi)含體形態(tài)

透射電鏡觀察到病組織中有正六邊形、風(fēng)輪狀、卷筒狀、束狀和晶體狀5種內(nèi)含體(圖1a～e)，不同樣品內(nèi)含體不完全相同。樣品寶佳及熱情中分別觀察到晶體狀和正六邊形內(nèi)含體，樣品精萃中觀察劍輪狀、卷筒狀、束狀3種內(nèi)含體，而西伯利亞和阿蒂琳娜中沒有觀察到內(nèi)含體。

2．3病毒粒子形態(tài)

電鏡觀察結(jié)果表明，帶病組織中含有4種可觀察到的病毒粒子，其形狀分別為球狀、線狀(短)、線狀(長)、短桿狀，不同樣品所含病毒粒子種類不完全相同。其中球狀病毒粒子僅在樣品寶佳中存在，其直徑平均為29.5 nm，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，此球狀病毒粒子有一個(gè)黑色的中心。因黃瓜花葉病毒(CMV)粒子大小29～30 nm，中心有一個(gè)12 nm的電子致密中心，另一方面，此樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果與CMV的ELISA檢測(cè)結(jié)果一致，因此將該球狀病毒確定為黃瓜花葉病毒(CMV)(圖1f)。線狀(短)病毒粒子存在于樣品寶佳、西伯利亞、精萃和阿蒂琳娜中，其大小為593.29～639.97 nm×12.15～14.12 nm(圖1g)，由于百合無癥病毒(LSV)平均大小550～650 nm×12～15 nm，另一方面，此結(jié)果與LSV的DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果一致，因此將此線狀(短)病毒粒子確定為百合無癥病毒。

在觀賞百合樣品精萃中觀察到兩種線狀病毒粒子，其中一種較短，大小、形態(tài)與百合無癥病毒粒子相近，而另一種線狀病毒粒子較百合無癥病毒粒子長，平均大小為757.58～846.25 nm×12.12～12.75 nm(圖1h)，同時(shí)超薄切片觀察到風(fēng)輪狀、帶狀和卷筒狀內(nèi)含體，這與報(bào)道的侵染百合的馬鈴薯Y病毒的大小以及在寄主體內(nèi)形成風(fēng)輪狀內(nèi)含體的結(jié)論一致，所以，將這種病毒粒子確定為馬鈴薯Y

病毒。在觀賞百合樣品熱情中觀察到短桿狀的病毒粒子，平均大小為500～807.69 nm×153.85～192.31 nm(圖li)，以及正六邊形內(nèi)含體，這種短桿狀病毒粒子的形態(tài)與煙草脆裂病毒相似，而且據(jù)報(bào)道煙草脆裂病毒在寄主體內(nèi)可形成正六邊形內(nèi)含體，因此將這種病毒初步確定為煙草脆裂病毒。

2．4不同癥狀觀賞百合葉片中病毒粒子及內(nèi)含體比較

對(duì)不同癥狀觀賞百合葉片中病毒粒子及內(nèi)含體觀察比較結(jié)果表明，癥狀表現(xiàn)為葉片卷曲，有凸凹不平的泡斑狀花葉樣品寶佳中，存在線狀和球狀兩種病毒粒子，線狀病毒粒子較少；癥狀為葉脈綠色、葉肉黃化狀花葉的樣品西伯利亞和植株矮化、葉片呈黃綠相間的花葉的阿蒂琳娜中存在線狀病毒粒子，其形態(tài)和大小與寶佳中觀察到的線狀病毒一致；兩種病毒粒子大小和形態(tài)以及ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，西伯利亞和阿蒂琳娜受到百合無癥病毒的侵染，寶佳同時(shí)受到百合無癥病毒和黃瓜花葉病毒的復(fù)合侵染；在癥狀為深、淺綠相間的斑駁狀花葉的樣品精萃中除了上述觀察到的無癥病毒線狀粒子外，還存在一種比這種病毒粒子較長的馬鈴薯Y病毒線狀粒子，由此可見，樣品精萃同時(shí)受到百合無癥病毒和馬鈴薯Y病毒的共同侵染；在癥狀表現(xiàn)為扁莖，葉簇生，莖稈扭曲的樣品熱情則受到煙草脆裂病毒的侵染(表3)。

3結(jié)論與討論

觀賞百合病毒病癥狀類型復(fù)雜多樣，本研究對(duì)癥狀表現(xiàn)為不同花葉和扁莖、葉簇生、莖稈扭曲的5個(gè)觀賞百合樣品進(jìn)行了電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)侵染甘肅省觀賞百合的病毒粒子有球狀、短線狀、長線狀和短桿狀4種形態(tài)。根據(jù)病毒粒子的形態(tài)、大小及不同內(nèi)含體的形態(tài)和ELISA檢測(cè)結(jié)果，5個(gè)供試觀賞百合樣品均受到病毒侵染，其中最主要的是cMV和LSV，另外還存在有馬鈴薯Y病毒和煙草脆裂病毒；有時(shí)同一植株受到多種病毒的復(fù)合侵染，具有病毒多樣性的特點(diǎn)。上述試驗(yàn)結(jié)果為我們運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行觀賞百合病毒種類的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。在對(duì)病毒的電鏡觀察研究中，采用了負(fù)染色法和超薄切片法兩種方法，結(jié)合兩者的特點(diǎn)，獲得更多的信息，如切片負(fù)染有利于球狀病毒的觀察，避免病毒粒子與組織難以區(qū)分的問題，而汁液負(fù)染則有利于線狀病毒的觀察，這也就是ELISA檢測(cè)結(jié)果表明在樣品寶佳中存在球狀病毒和線狀病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，在電鏡觀察中并沒有觀察到兩種病毒存在于同一個(gè)視野而兩種長、短不同的線狀病毒存在于同一視野中的原因。因此，有關(guān)觀賞百合受多種病毒復(fù)合侵染的問題以及表現(xiàn)為其他癥狀的觀賞百合病毒病原、病毒粒子形態(tài)以及內(nèi)含體的有無仍有待于進(jìn)一步研究。