殼聚糖的理化性及其作為免疫佐劑的研究進展

摘要：免疫佐劑是一種免疫調節(jié)劑，可增強抗原的免疫原性、提高免疫效果。為增強疫苗的免疫原性在病毒性疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗的研制中常加入免疫佐劑。目前批準可用于人體的免疫佐劑是鋁佐劑，因只能引起體液免疫，不能有效誘導細胞免疫，因此尋找新的免疫佐劑已成為疫苗研制迫切需要解決的問題。研究表明，殼聚糖具有免疫佐劑效應，具有良好的組織相容性，可生物降解，安全無毒，因此殼聚糖將成為一種很有應用價值的免疫佐劑。本文就殼聚糖的理化性及其免疫佐劑研究做一綜述。

關鍵詞：殼聚糖；理化性；免疫佐劑；疫苗

殼聚糖（Chitosan），也稱幾丁聚糖、脫乙酰幾丁質、聚氨基葡萄糖、可溶性甲殼素，化學名為β（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，由蝦、蟹等富含甲殼素的物質經(jīng)脫鈣、脫蛋白、脫色、脫乙酰等工藝加工而成，是甲殼質脫乙酰反應后的物質，為分子量90～120kDa的生物大分子。從Braconot于1811年描述甲殼素迄今，甲殼素和殼聚糖的發(fā)展歷史已有100多年。但由于殼聚糖具有提高免疫、活化細胞、預防癌癥、抗衰老，調節(jié)機體等作用，因此在醫(yī)藥、保健、食品等多領域具廣泛的用途。

1殼聚糖的理化性

甲殼素[1]廣泛存在于甲殼綱動物蝦和蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌（酵母、霉菌）的細胞壁和植物（如蘑菇）的細胞壁中。自然界每年生物合成的甲殼素將近100億噸，是自然界中儲量僅次于纖維素的第二大天然有機化合物。殼聚糖是甲殼素的N-脫乙?；漠a(chǎn)物，通常把脫去55%以上N-脫乙酸基，且能溶于1%乙酸或1%鹽酸的甲殼素稱之為殼聚糖。甲殼素與殼聚糖的差別，僅僅是N-脫乙酰度不同而已。殼聚糖是白色無定形、半透明、略有珍珠光澤的固體。因原料不同和制備方法不同，分子量有差異，不溶于水和堿溶液，可溶于稀的鹽酸、硝酸等無機酸和大多數(shù)有機酸。在稀酸中，殼聚糖的主鏈會緩慢水解，溶液的黏度也會逐漸降低。殼聚糖氨基的氮原子上具有一對未公用的電子，能從溶液中結合一個氫質子，從而使殼聚糖成為帶陽電荷的聚電解質，破壞殼聚糖分子內和分子間的氫鍵，使之溶于水中。殼聚糖的溶解度至少受3個因素的影響：①脫乙酰度。脫乙酰度越高，分子鏈上的游離氨基越多，離子化強度越高，也就越易溶于水；反之脫乙酰度越低，溶解度越小。②分子量。分子量越大，溶解度越小，因為殼聚糖分子內和分子間的氫鍵使得分子彼此纏繞在一起且比較僵硬。③酸的種類。稀硫酸，稀磷酸不能溶解殼聚糖。

殼聚糖溶液的穩(wěn)定性在使用過程中特別重要。殼聚糖的糖苷鍵是半縮醛結構，這種半縮醛結構對酸是不穩(wěn)定的。殼聚糖的酸性溶液在放置過程中會發(fā)生酸催化的水解反應，殼聚糖分子的主鏈不斷降解，黏度越來越低，分子量逐漸降低，最后被水解成寡糖和單糖。殼聚糖稀溶液的黏度不僅和溶液的PH有關系，也與殼聚糖的分子量有關系，殼聚糖分子量越高，其溶液的黏度就越大，分子量越低，黏度就越小。殼聚糖稀溶液的離子強度直接影響殼聚糖分子在溶液中的形態(tài)。殼聚糖能被人體吸收利用，與人體的組織器官及細胞有良好的組織相容性，無毒，具有生物降解性，幾乎無免疫原性，同時具有多種生物活性。經(jīng)過化學改性得到的殼聚糖衍生物， 其物理化學性質得到改善， 使其應用范圍大大拓展， 因此殼聚糖及其衍生物的開發(fā)及應用研究已引起人們廣泛的興趣。

2殼聚糖作為DNA疫苗的免疫佐劑研究

有效的疫苗都需要一個合適的抗原傳遞系統(tǒng)，即存在佐劑依賴性或載體依賴性。許多研究表明殼聚糖可有效的促進局部，特別是粘膜局部的免疫反應，增強抗原傳遞系統(tǒng)功能，具有免疫佐劑的效應。DNA疫苗是利用重組DNA技術將保護性抗原蛋白基因克隆到真核表達載體，然后將重組的質粒DNA直接導宿主體內，使抗原蛋白經(jīng)過內源性表達遞呈給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫反應，從而達到預防和治療疾病的目的。盡管DNA疫苗已經(jīng)用于治療一些動物疾病，但DNA疫苗在人體的免疫原性弱，不能有效誘導免疫應答限制了它的應用。將基因疫苗涂抹在皮膚表面進行免疫，由于免疫原性弱，影響皮膚對質粒的吸收及免疫效果，同時由于質粒本身容易降解，不能產(chǎn)生足夠高的抗體水平來保護宿主不受疾病的感染。殼聚糖及其衍生物能與DNA形成聚電解質聚合物，對質粒DNA進行保護，可減少質粒DNA的降解，增強免疫細胞的識別，延長疫苗的作用時間，從而加強免疫效果。王焱冰[2]等以殼聚糖包裹不同的草原兔尾鼠卵透明帶3(LZP3)基因DNA疫苗pcDNA3-Lzp3(pLzp3)和pLC，通過皮膚擦拭免疫小鼠，以ELISA方法檢測抗體水平，對卵巢做病理切片檢測。ELISA結果顯示用殼聚糖包裹的pLC組在皮膚免疫中顯示出優(yōu)勢，卵巢病理切片結果正常，說明殼聚糖包裹質粒皮膚免疫小鼠較純質粒免疫效果更為顯著。殼聚糖-DNA提高了皮膚免疫效果，有望成為一種有效的介導DNA疫苗進行皮膚免疫的載體物質?？诜捅乔唤臃N疫苗能夠誘導黏膜免疫，這種局部免疫對于抵御經(jīng)黏膜感染的病原微生物是極其重要的。然而，口服疫苗在消化道內易被降解，抗原的吸收效率低 。經(jīng)鼻腔接種的疫苗雖不像在腸道內那樣降解明顯，但在鼻腔內半清除時間僅15 min，抗原很難逾越上皮屏障。將疫苗和遞呈系統(tǒng)混合制備成微粒，就可以有效地防止疫苗在到達黏膜組織前被降解，因此許多學者將殼聚糖用于黏膜遞呈和免疫佐劑作用研究。

胡云章[3]等選取乙肝病毒表面抗原的亞單位疫苗及DNA疫苗作為模型，以殼聚糖作為載體，通過沉淀/凝聚法制備殼聚糖微球疫苗，構建了鼻腔免疫釋放系統(tǒng)，對其免疫效果進行分析，并與腹腔及肌肉注射免疫方法進行比較。結果表明，在HBV亞單位疫苗誘導的免疫應答中，微球疫苗體現(xiàn)出一定程度的緩釋作用，腹腔免疫及鼻腔免疫在產(chǎn)生抗體應答方面的差異無顯著意義，由此提示鼻腔免疫可以作為亞單位微球疫苗接種的新型途徑，但其有效性還待進一步確定。在HBV DNA微球疫苗所誘導的免疫應答中，傳統(tǒng)形式肌肉注射所誘導的IgG應答在12周時升至最高，隨后出現(xiàn)下降趨勢；而微球形式的肌肉注射和鼻腔免疫所誘導的IgG應答，則在16周時才達最高，且峰值遠遠高于傳統(tǒng)形式肌肉注射組。說明殼聚糖微球對于DNA疫苗具有保護作用及緩釋作用，能夠使誘導的IgG應答水平閾值的時間延長，并且鼻粘膜可能比肌肉組織更有利于吸收和提呈DNA疫苗。此實驗表明微球疫苗鼻腔免疫能夠有效誘導機體的免疫應答，產(chǎn)生很好的免疫保護力和免疫記憶，為發(fā)展一種疫苗新型免疫形式及途徑提供了理論依據(jù)。

Jiang等對殼聚糖-乙肝核心抗原微粒能否誘導更強的免疫應答及其潛在機制進行了探討。結果顯示和裸DNA相比吞噬細胞對殼聚糖微粒有較高的攝取率；殼聚糖微粒注射部位未見明顯組織學改變。高抗體效價、高水平IFN-γ的分泌說明殼聚糖微粒顯著提高了免疫原性。Khatri 等對乙肝病毒殼聚糖微粒鼻粘膜免疫進行了研究。復凝聚法制備具有特定大小、形態(tài)、表面電荷、荷載率和抗核酸酶消化能力及高轉染效率的乙肝病毒殼聚糖微粒。結果顯示鼻粘膜免疫后乙肝病毒殼聚糖微粒誘導的血清抗HBsAg抗體滴度比裸DNA疫苗和鋁佐劑疫苗均要低，而且既能誘導粘膜分泌sIgA，也能產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。此研究表明殼聚糖微粒作為DNA疫苗的載體和佐劑，通過鼻粘膜免疫途徑，能誘導有效的免疫反應。

3殼聚糖作為微生物疫苗的免疫佐劑研究

Kang等采用三聚磷酸鹽與殼聚糖發(fā)生離子交聯(lián)的方法，制備得到包裹支氣管敗血性博德特氏菌皮膚壞死毒素(BBD)的殼聚糖載藥微球。然后將載有BBD的殼聚糖微球直接通過鼻腔給大鼠進行免疫后，采用ELISA法來檢測血清、鼻流出液及唾液中BBD特異的免疫反應。結果顯示，鼻腔中BBD特異的IgA抗體滴度和血清中的IgG及IgA滴度均與給藥時間和給藥劑量有關。說明鼻內免疫對鼻相關的淋巴樣組織有靶向作用，同時也說明殼聚糖對于鼻黏膜免疫具有免疫佐劑作用。常海燕[4]等將殼聚糖和流感病毒滅活疫苗混合后經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠，免疫后檢測血清中IgG抗體及鼻洗液中IgA抗體水平，加強免疫后1周，用致死性(40LD50)流感病毒A/PR/8/34(H1N1)攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖作佐劑能顯著增強血清抗體含量，并提高小鼠抗病毒攻擊的能力。Read等則將殼聚糖和三價流感滅活疫苗一起鼻腔及肌肉免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以明顯提高其局部和血清抗體反應。研究結果顯示殼聚糖作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑，可以增強疫苗的抗體反應。

謝勇[5]等對以殼聚糖為佐劑的幽門螺桿菌疫苗的免疫保護作用及其機制進行了深入的研究。他們將BALB/c小鼠隨機分為空白對照組（PBS溶液）、殼聚糖酸溶液組、殼聚糖顆粒組、Hp抗原組、Hp抗原+殼聚糖酸溶液組、Hp抗原+殼聚糖顆粒組、Hp抗原+霍亂毒素（CT）組、Hp抗原+殼聚糖酸溶液+CT組及Hp抗原+殼聚糖顆粒+CT組，各組于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次。結果顯示以殼聚糖為佐劑的Hp疫苗的免疫保護率達60％，與以CT為佐劑的Hp疫苗的免疫保護率(58.33％)相似，同時以CT+殼聚糖為佐劑的Hp疫苗的保護率為84.62％、85.71％。含佐劑的Hp疫苗所誘導產(chǎn)生的Hp IgG水平顯著高于對照組及無佐劑組，而以CT+殼聚糖為佐劑組所產(chǎn)生的抗Hp IgG水平顯著高于僅以CT或殼聚糖為佐劑組。胃黏膜內sIgA及特異性抗Hp IgA水平在殼聚糖為佐劑組與以CT為佐劑組無差別，顯著高于無佐劑組，而殼聚糖與CT聯(lián)合應用組顯著高于單以CT為佐劑組。研究結果表明以殼聚糖為佐劑的Hp疫苗對Hp感染具有免疫保護作用，并可成功誘導黏膜局部的特異性體液免疫應答，這可能在其免疫防御中起作用；而且可促進Thl和Th2的混合免疫反應，逆轉Hp感染所致Th2反應的抑制、使Thl和Th2反應達到平衡，從而發(fā)揮其免疫保護作用。

Ahire 等對殼聚糖包裹的破傷風毒素（tetanus toxoid，TT）疫苗誘導的全身和局部免疫應答進行了研究。小鼠隨機分為殼聚糖+TT抗原組（Chitosan encapsulated tetanus toxoid ，CS-TT）、TT抗原組、殼聚糖組，三組均經(jīng)口服途徑免疫小鼠。ELISA法檢測血清中抗破傷風毒素IgG，檢測洗腸液及糞便中抗破傷風毒素IgA。觀察到CS-TT組小鼠的免疫反應有劑量依賴性，全身和局部免疫有很大程度的提高，表明殼聚糖微粒懸液包裹了高分子量的破傷風毒素，誘導了腸的IgA分泌和體循環(huán)的IgG的產(chǎn)生。David等將殼聚糖抗原蛋白溶液皮下免疫小鼠，結果顯示小鼠特異性抗體滴度增加5倍，脾CD4+ T細胞增值增加6倍。強的抗體滴度增長和遲發(fā)型超敏反應（DTH）揭示殼聚糖誘導了體液免疫和細胞免疫?？赡艿臋C制為：粘稠的殼聚糖溶液增加了抗原的滯留時間，免疫7天后，大于60%的抗原蛋白仍保留在注射部位；殼聚糖誘導了67%引流淋巴結細胞的瞬時膨脹，膨脹的高峰期持續(xù)在殼聚糖免疫后14-21天，之后以多糖的方式降解。

結語。綜上所述，殼聚糖作為免疫佐劑，通過皮膚、口服、鼻腔、皮下等不同的免疫途徑，在多種疫苗研究中發(fā)揮重要作用，可有效的誘導局部黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫反應。殼聚糖及其衍生物良好的生物黏附性，促進吸收作用及免疫調節(jié)作用使其在疫苗黏膜給藥系統(tǒng)中的應用有著其他載體材料不可比擬的優(yōu)勢。以殼聚糖為佐劑的生物黏附給藥系統(tǒng)可顯著提高藥物在各黏膜表面的滯留時間，從而提高生物利用度。隨著研究的不斷深入，殼聚糖作為免疫佐劑必將發(fā)揮更重要的作用。

參考文獻

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