己烯雌酚對體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細胞的作用

[摘要]目的:觀察不同濃度外源性雌激素己烯雌酚（Diaethylstilbestro，DES）對體外培養(yǎng)人正常黑素細胞的細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響。方法:采用MTT法測定黑素細胞增殖情況，參考Nakajima M方法測定酪氨酸酶活性。結果:不同濃度己烯雌酚對體外培養(yǎng)人黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性均有促進作用。結論:己烯雌酚能促進人黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性，對相關皮膚色素性疾病可能有一定的治療作用。

[關鍵詞]己烯雌酚；黑素細胞；酪氨酸酶

[中圖分類號]R329.25[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

Effects of Diaethylstilbestro（DES） on cultured human melanocytes in vitro

GONG Shi1， ZHANG Qing2， ZHAO Zhi-Guo2，lIU Qiao 1，CHENG Yong-jun1，WANG Ai-min1，YANGXian-xiu1 ，CHEN Kang1

(1.Department of Dermatology，Hai nan Provincial Skin Disease Hospital，Haikou， 570206 Hainan，China; 2.Department of Pharmacology， Guiyang Medical College)

Abstract: ObjectiveEstablishing the culture of human normal melanocytes in vitro，and studying the effects ofDiaethylstilbestro（DES） on cultured human melanocytes. MethodsViability of melanocytes were measured by MTT method;tyrosinase activity was measured by utilization of L-Dopa as the substrate(Nakajima M.method ). ResultsDifferent dosage ofDiaethylstilbestro（DES）induced a strong promotion on melanocytic viability and tyrosinase activity. Conclusion Diaethylstilbestro（DES）can promote melanocytic proliferation and tyrosinase activity. Diaethylstilbestro might have some therapentical effects on correlated pigmented skin diseases.

Key words: Diaethylstilbestro（DES）; Melanocytes ;Tyrosinase

早期研究觀察到外源性雌激素局部和系統(tǒng)使用均能引起人類皮膚色素沉著。SD-McLeod等[1]早在1994年就證實內(nèi)源性雌激素能促進體外培養(yǎng)人表皮黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性，最近的細胞免疫化學研究也證明了成人包皮來源體外培養(yǎng)的黑素細胞可表達雌激素受體[2]。多年來，雌激素對人表皮黑素細胞作用的研究主要是圍擾內(nèi)源性雌激素，且隨著雌激素皮膚受體的精確定位，逐步證實大部分與雌激素受體結合的配基（包括外源性雌激素）有很相似的結合構象。另有報道稱人工合成的己烯雌酚（Diaethylstilbestro，DES）極易與體內(nèi)雌激素受體蛋白結合，具有比天然雌激素更強的基因表達[3]。因此本實驗利用體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細胞，研究了外源性雌激素—己烯雌酚對體外培養(yǎng)人黑素細胞的增殖及酪氨酸酶活性的影響，擬證實外源性雌激素（DES）的活性，為進一步理解內(nèi)、外源性雌激素活性異常所造成的皮膚病理過程提供參考。

1材料和方法

1.1試劑：己烯雌酚1ml：2mg（針劑規(guī)格，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：H31021403），黑素細胞培養(yǎng)液（美國Cascade公司產(chǎn)品），DispaseⅡ酶（瑞士Roche公司產(chǎn)品，購自第三軍醫(yī)大學），左旋多巴（L-dopa，Sigma公司產(chǎn)品），噻唑藍（MTT），二甲基亞砜（DMSO），TritonX-100（購Sigma公司）。

1.2 儀器：OLYMPUS倒置顯微鏡(CK40)，Thermo-forma CO2孵箱，Eppendorf-5810R低溫離心機，美國Bio-tck酶標儀（ELX800）等。

1.3 藥物制備[1，4-5]:將己烯雌酚注射液在無菌條件下用黑素細胞基礎培養(yǎng)基倍比稀釋成以下濃度：10-4M，10-6M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M 。其中，10-9 ～10-11M為人體內(nèi)源性雌激素生理濃度，M=mol/L，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4正常人黑素細胞的培養(yǎng)及傳代[6-7]：取3～20歲正常人包皮環(huán)切標本，生理鹽水反復多次沖洗，去除皮下組織，切成3mm×5mm的小條，DispaseⅡ酶4℃消化15h后，仔細分離表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，終止消化后吹打成單細胞懸液，篩網(wǎng)過濾后離心，以5×106/ml接種于含黑素細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。置入CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，24h后首次換液以去除未貼壁細胞，然后按情況進行換液。原代接近融合時，胰酶消化傳代，實驗選用2～4代細胞。

1.5 黑素細胞鑒定[8-9]：收集第二代細胞進行HE染色和脫色素HE染色及多巴，S-100免疫組化染色（一抗為小鼠抗人S-100蛋白抗體）鑒定。

1.6 MTT法測定不同濃度外源性雌激素對黑素細胞增殖的影響：MTT 法實驗操作用四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法。選擇對數(shù)生長期MC，胰酶消化后，調整細胞濃度為5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)孵育，細胞貼壁后12h棄上清→分別加入不同濃度己烯雌酚液20uL/孔，培養(yǎng)液180 uL/孔，繼續(xù)MC細胞培養(yǎng)。該項實驗以無藥培養(yǎng)液換液做對照（200uL/孔），每一濃度設4個重復孔→ 觀察72h分別加入MTT 20ul/孔，繼續(xù)孵育4h后棄上清，加二甲基亞砜(DMSO)200uL/孔，振蕩10min，置酶標儀上測定吸光度值，激發(fā)波長為570nm處，參考波長為630nm測OD值。計算MC增長率(%)=(A各濃度/A正常-1)×100% 。

1.7 酪氨酸酶活性測定[10]：細胞接種方法同上，藥物作用3 天后，棄去上清液，0.01mol/L的PBS 洗2 次，每孔加90μl 10ml/L 的TritonX-100，震蕩5min 以溶解細胞，每孔再加10μl 質量分數(shù)為0.1 %的左旋多巴溶液，37℃孵育30min，振搖后在高通量多功能微板測試系統(tǒng)490nm 波長處比色。酪氨酸酶活性增殖率=[1-(各濃度平均吸光度值- 空白孔平均吸光度值)/(對照組平均吸光度值- 空白孔平均吸光度值)]×100%。

1.8統(tǒng)計學處理：采用SPSS軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性意義。

2結果

2.1形態(tài)學結果：體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞為樹突狀細胞，有較多樹突，胞體內(nèi)可見黑素顆粒，細胞增殖良好，連接成網(wǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行傳代培養(yǎng)，約7～10天傳一代(見圖1)。

2.2黑素細胞鑒定：HE染色，黑素細胞呈梭形，有2～3個樹突，核藍紫色，胞漿呈粉紅色(見圖3)；脫黑素HE染色，胞漿呈藍色，樹突呈淡藍色，細胞內(nèi)色素顆粒全部脫去(見圖4)；Dopa染色，可見細胞漿內(nèi)陽性著色(黑色或灰色)(見圖5)；S-100蛋白染色陽性，細胞漿呈棕黃色染色，從而可以鑒定為黑素細胞(見圖6)

2.3不同濃度外源性雌激素（DES）對人正常皮膚黑素細胞增殖率(%)的影響：由表1可見，10-4～10-11mol/L的己烯雌酚（DES）均對人正常皮膚黑素細胞具有不同程度的促增殖作用，其中10-8mol/L濃度的DES對黑素細胞促增殖活性最明顯(增殖率為88.9%)；從10-9mol/L濃度到10-11mol/L濃度，增殖率開始依次下降。不同濃度外源性DES孵育的黑素細胞于72h經(jīng)方差分析表明：各濃度組與空白對照組相比較， 10-4mol/L濃度組，10-6 mol/L濃度組和10-11mol/L濃度組差異無顯著性（P＞0.05）；10-9mol/L濃度組和10-10mol/L濃度組與空白對照組相比較，差異有顯著性（P＜0.05）；10-8mol/L濃度組與空白對照組相比較，差異亦有顯著性（P＜0.01），證實10-8mol/L濃度組，10-9mol/L濃度組和10-10mol/L濃度組均可促進黑素細胞增殖。

2.4 不同濃度外源性雌激素（DES）對人正常皮膚黑素細胞酪氨酸酶活性的影響：表2顯示，不同濃度外源性雌激素（DES）對體外培養(yǎng)人正常皮膚黑素細胞酪氨酸酶活性有劑量依賴性： 10-4～10-8mol/L的己烯雌酚（DES）作用逐漸增高，10-8 mol/L作用最強（97.5%），這一結果與MTT檢測結果很相似；但是，10-10mol/L時，作用微弱（19.5%），10-11mol/L則幾乎無明顯影響(4.9%)。經(jīng)方差分析表明：各濃度組與空白對照組相比較，10-4 mol/L濃度組，10-6 mol/L濃度組和10-11mol/L濃度組差異無顯著性（P＞0.05）；10-10mol/L濃度組和10-9mol/L濃度組與空白對照組相比較，差異有顯著性（P＜0.05）；10-8 mol/L濃度組與空白對照組相比較，差異也有顯著性（P＜0.01），證實10-8mol/L濃度組、10-9mol/L濃度組和10-10mol/L濃度組均可增強黑素細胞酪氨酸酶活性。

3討論

早期的研究已經(jīng)觀察到雌激素能引起人類皮膚色素沉著，如：服用含雌激素口服避孕藥后，部分女性面部可能會出現(xiàn)色素沉著，且局部應用含雌激素的軟膏也會引起局部色素沉著。這些是比較常見的外源性雌激素引起的色素沉著，它極大的影響人們的美觀[11]。

雌激素對皮膚不同類型細胞，諸如表皮角質形成細胞，真皮成纖維細胞以及黑素細胞，都有著顯著效應。它也關系到毛囊、皮脂腺、頂泌汗腺等附屬器官的調節(jié)功能，對皮膚老化、色素形成、毛發(fā)生長、皮脂分泌乃至皮膚腫瘤都有顯著調節(jié)作用[12]。外源性雌激素在結構或功能上與內(nèi)源性雌激素很相似，可模擬或干擾內(nèi)源性雌激素功能，與人體各臟器雌激素受體結合后發(fā)揮廣泛作用。己烯雌酚是人工合成雌激素，與天然雌二醇結構相似，它目前仍是臨床常用藥物。本研究以人體生理雌二醇濃度為參考，設計不同濃度組的外源性己烯雌酚，利用MTT比色方法和Boyd MR等的方法分別檢測不同濃度外源性DES對體外培養(yǎng)人正常黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響。結果顯示：不同濃度外源性DES對黑素細胞增殖均有活性，其中，10-8mol/L濃度和高效劑量組作用最強；同時，對黑素細胞酪氨酸酶活性影響特點如下：外源性DES在10-4～10-8mol/L濃度，作用逐漸增高，其中，10-8 mol/L作用最強；但10-10mol/L時，作用微弱（2.17%），10-11 mol/L則無明顯影響。這一結果與內(nèi)源性雌激素對體外培養(yǎng)黑素細胞增殖作用的現(xiàn)有研究報道基本吻合。由于MC增殖和其活性增強對臨床皮膚脫色后復色起決定作用，研究結果表明一定的臨床藥物劑量調整，可能會避免或減少色素沉著的發(fā)生。

總之，通過本實驗，使內(nèi)、外源性雌激素對人體皮膚色素形成的作用研究進一步擴大，也增加了它的皮膚臨床應用前景。

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[收稿日期]2008-03-11[修回日期]2008-05-05

編輯/李陽利