人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究

[摘要]目的：分離篩選人牙周膜干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性并進(jìn)行初步鑒定。方法：采用STRO-1為標(biāo)記物以免疫磁珠分離篩選人牙周膜干細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長及克隆形成情況，流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期、細(xì)胞表型分析，免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測STRO-1、Vimentin表達(dá)，并測定細(xì)胞體外多向分化能力。結(jié)果：免疫磁珠法可獲得人牙周膜干細(xì)胞，細(xì)胞具有克隆形成能力，增殖速度低。細(xì)胞周期分析大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，為慢周期性;細(xì)胞表型分析證實(shí)CD146、CD44高表達(dá)，CD34、CD45低表達(dá)。STRO-1及Vimentin均為陽性染色，礦化誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)證實(shí)該細(xì)胞具有多向分化能力。結(jié)論：免疫磁珠法是有效的分離純化牙周膜干細(xì)胞的方法。所分離細(xì)胞具有干細(xì)胞的細(xì)胞周期、表型特點(diǎn)及多向分化能力。

[關(guān)鍵詞]干細(xì)胞；人牙周膜干細(xì)胞；免疫磁珠；流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)；免疫細(xì)胞化學(xué)

[中圖分類號(hào)]R783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2008）05-04

Isolation， identification and bionomics of human periodontal ligament stem cells

PAN Feng1，DING Yin1，WANG Guang1，ZHAO Yu2，NI Hua2

(1.Department of Orthodontics，Stomatology Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Center of Tissue Engineering， Stomatology Hospital，The Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells， meanwhile， CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.

Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry

研究證實(shí)牙周膜內(nèi)存在具有橫向分化能力的干細(xì)胞(牙周膜干細(xì)胞)，在體外微環(huán)境作用下還可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞[1-2]。因此，牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）作為一種新發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞，在牙周組織工程研究中有較大的應(yīng)用前景。但是牙周膜組織量小、分離困難，一直成為制約牙周膜干細(xì)胞研究的重要原因。已有的克隆篩選法操作程序繁瑣，周期較長[1]，因此需要尋找簡便、快捷的篩選方法來分離牙周膜干細(xì)胞。本研究應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行篩選，并擴(kuò)增培養(yǎng)，通過對(duì)牙周膜干細(xì)胞生長曲線、克隆形成率、細(xì)胞周期、細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物測定及多向分化能力的研究對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期建立一種便捷有效的分離方法并明確牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究牙周損傷的發(fā)病機(jī)理及臨床治療提供基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備：α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），羊抗小鼠磁珠試劑盒（Dynalbiotech，美國)，基質(zhì)蛋白-l單克隆抗體(STRO-1，RD，美國)， ABC型免疫組化檢測試劑盒(Dkao，美國)；小鼠抗人波形絲蛋白單抗(Vimentin，Dkao，美國)；CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體（Beckmen Coulter，美國）；CO2孵箱(Heraeus，德國)；YJ-875型超靜工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠，中國)；流式細(xì)胞分析儀(Beckmen Coulter，美國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材及細(xì)胞培養(yǎng)：收集臨床拔除的正常人牙周健康、無齲的新鮮第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，移入10cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加少許α-MEM培養(yǎng)液保持組織濕潤，銳性分離牙周膜組織約1mm3組織塊，將分離的組織塊以1mm間距平鋪于6孔板內(nèi)，以無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入培養(yǎng)液(含100ml/L 胎牛血清，100μmol/L2抗壞血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液)，置入37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養(yǎng)，待多數(shù)組織塊周圍有細(xì)胞游出后去除蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)，每3天換液1次，細(xì)胞生長達(dá)80%匯合時(shí)傳代。

1.2.2磁珠分離篩選牙周膜干細(xì)胞：將5μl磁珠劇烈振蕩后移入離心管內(nèi)，加入5ml含1％胎牛血清的PBS沖洗，放置于磁力架上靜置2min后去上清，重復(fù)一次后重懸，置4℃?zhèn)溆谩Ｊ占?代人牙周膜細(xì)胞1×108個(gè)，以含1％胎牛血清的PBS重懸，加入小鼠抗人STRO-1抗體，4℃孵育60min，每隔10min輕振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除殘留抗體后重懸并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min輕振一次。離心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重懸，將離心管置于磁力架上2min，緩慢棄除上清及未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重懸并清洗與磁珠結(jié)合的細(xì)胞2次，棄上清，加入磁珠分離液，輕晃均勻2min后置于磁力架上2min，取上清液，重復(fù)2次以去除殘存磁珠，離心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml接種于6孔板內(nèi)，37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究

1.3.1細(xì)胞生長曲線測定：分別取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞，以1×103cells/孔接種于96孔塑料板，每組3孔，隔日換液。每天取一組，MTT法測各孔OD值，連續(xù)測10天，以時(shí)間為橫軸、細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線。

1.3.2 克隆形成率測定：將收集的對(duì)數(shù)生長期牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)上清1 500rpm離心10min，經(jīng)0.22μm直徑的小濾器過濾后，與培養(yǎng)基以l:l比例混合作為適應(yīng)性培養(yǎng)基。取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至10～15個(gè)/ml，100μ1/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12h后標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，并補(bǔ)液至200μ1/孔，5天換液，光鏡下觀察克隆形成情況。

1.3.3 流式細(xì)胞儀分析

1.3.3.1細(xì)胞周期分析：取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml， PBS清洗2次，加入0.01mol/LPBS重懸，再加入預(yù)冷的無水乙醇2ml吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙錠1ml，4℃30min，過300目的尼龍篩網(wǎng)，流式細(xì)胞儀上機(jī)，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.3.3.2表面抗原測定：取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞， 棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，以含0.25% 胰蛋白酶的PBS液消化5 min，制成單細(xì)胞懸液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮鈉的磷酸鹽緩沖液(流式緩沖液)沖洗細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×109/L，每個(gè)Eppendof管加100μL細(xì)胞懸液，室溫下分別與CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體5μL避光孵育15min，再以流式緩沖液清洗細(xì)胞，1 000rpm離心5min，將細(xì)胞重懸于含1%多聚甲醛的流式緩沖液0.5ml固定。使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記。用流式細(xì)胞儀分析熒光細(xì)胞，專用配套軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽性率，單位用%表示。

1.3.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：取篩選培養(yǎng)的PDLSCs制備細(xì)胞爬片， 免疫細(xì)胞化學(xué)ABC法進(jìn)行STRO-1及Vimentin染色，陰性對(duì)照以PBS替代一抗，進(jìn)行細(xì)胞來源及表達(dá)檢測，光鏡下觀察。

1.3.3.4體外多向誘導(dǎo)分化：①礦化誘導(dǎo)：取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)24h后換礦化誘導(dǎo)液(100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)液)培養(yǎng)，隔日換液。培養(yǎng)3周后吸棄培養(yǎng)液， PBS清洗， 95%酒精固定10min ，PBS清洗2次，加入0.1%茜素紅(Alizarin Red-S)室溫染色30min，去離子水清洗3次，光鏡下觀察。②成脂誘導(dǎo)：取篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)24h后換成脂誘導(dǎo)液（地塞米松10-6mol/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5mmol/L、胰島素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)，隔日換液。培養(yǎng)3周后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油紅O染色10min，去離子水清洗3次，鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察：所篩選細(xì)胞大部分呈類梭形，核為卵圓形、位于胞質(zhì)中央，似成纖維樣細(xì)胞（如圖1）。

2.2 細(xì)胞生長曲線測定：牙周膜細(xì)胞及牙周膜干細(xì)胞生長曲線均呈倒“S”形，在接種后1天兩者細(xì)胞量均減少，自第2天起，細(xì)胞生長均加速，第8天達(dá)到生長高峰，進(jìn)入“平臺(tái)期”，此后，細(xì)胞生長速度減慢?？傮w而言，干細(xì)胞生長速度明顯低于牙周膜細(xì)胞（如圖2）。

2.3 牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性研究

2.3.1 克隆形成率：10～12天有細(xì)胞克隆形成，鏡下觀細(xì)胞呈集落狀生長，細(xì)胞形態(tài)成梭形，體積較小，排列緊密，中心細(xì)胞界限不清，呈圓形或不規(guī)則形狀，周邊細(xì)胞呈梭形或多角形。共獲得克隆株43株，克隆形成率為14.93％。

2.3.2細(xì)胞周期分析：細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示：大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期(78.2％)，即靜止期和DNA合成前期。G2期為2.3％，S期為19.5％。表明細(xì)胞增殖緩慢，大多數(shù)處于靜止期或緩慢增殖期(如圖3)。

2.3.3 細(xì)胞表型特征鑒定：表面抗原CD146和CD44檢測陽性率為92.8％及91.7％，CD34和CD45陽性率為1.6％及2.3％ （如圖4）。

2.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：篩選培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞中STRO-1及Vimentin均為陽性染色，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征（如圖5～6）。

2.3.5 成骨誘導(dǎo)：成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)8天后，細(xì)胞呈復(fù)層生長，局部增厚，12天左右中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。21天左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大。茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)（如圖7）。

2.3.6 成脂誘導(dǎo)：經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)至第10天左右，可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，較培養(yǎng)初期更為飽滿，至21天時(shí)油紅O染色陽性，細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量脂滴形成（如圖8）。

3討論

以往成體干細(xì)胞的分離純化常用方法有密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法、克隆化培養(yǎng)篩選，但這些方法操作繁瑣，且所需時(shí)間較長，不利于臨床應(yīng)用。根據(jù)干細(xì)胞表面特異性受體能選擇性結(jié)合或粘附其它信號(hào)分子的原理，采用免疫磁珠篩選、流式細(xì)胞分選法分離和鑒定干細(xì)胞己廣泛開展[3，9]。Seo[1]的研究結(jié)果顯示人牙周膜干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志STRO-1，并利用免疫磁珠篩選首次成功獲得人牙周膜干細(xì)胞。Gay等[4]使用STRO-1抗體對(duì)牙周膜細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，通過流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行篩選，獲得27％STRO-1陽性細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過使用包被二抗的免疫磁珠對(duì)復(fù)合STRO-1的牙周膜細(xì)胞進(jìn)行分離純化，獲得牙周膜干細(xì)胞，篩選程序簡單、迅速，細(xì)胞活性保持較好。經(jīng)細(xì)胞生長曲線測定，牙周膜干細(xì)胞較同一來源的牙周膜細(xì)胞生長慢，符合干細(xì)胞慢增殖周期的特點(diǎn)。

克隆形成能力是干細(xì)胞的特點(diǎn)，高秦等[10]對(duì)人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行了克隆化培養(yǎng)，結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)10～15天有克隆形成，克隆形成率為0.62％。Gay等[4]對(duì)牙周膜干細(xì)胞及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的克隆形成情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞有50個(gè)克隆形成，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有35個(gè)克隆形成，證實(shí)牙周膜干細(xì)胞有較強(qiáng)的克隆形成能力。成體干細(xì)胞處于由周圍間質(zhì)細(xì)胞及其所分泌的相關(guān)生長因子或配體形成的微環(huán)境中，這些生長因子或配體與干細(xì)胞相互作用，控制干細(xì)胞的更新和分化。故為提高克隆形成率并盡可能的保持純化后的細(xì)胞的未分化狀態(tài)，本研究借鑒了高秦等[10]人牙周膜干細(xì)胞克隆化培養(yǎng)的方法，收集了牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)上清與普通培養(yǎng)基以一定比例混合，制備成適應(yīng)性培養(yǎng)基，對(duì)所篩選的牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行了克隆化培養(yǎng)，共得到43個(gè)克隆，克隆形成率為14.93％，證實(shí)所獲得細(xì)胞具有干細(xì)胞自我更新的特性。

細(xì)胞周期是反映細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的重要指標(biāo)。干細(xì)胞是處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的一群細(xì)胞，這種慢周期的特點(diǎn)是大多數(shù)成體干細(xì)胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干細(xì)胞周期也會(huì)相應(yīng)變化[13-14]。本研究對(duì)所篩選牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期分析顯示，與高秦等[10]的結(jié)果有一定差異，可能原因有：①細(xì)胞來源不同，因不同個(gè)體的干細(xì)胞狀態(tài)不會(huì)完全一致；②細(xì)胞獲取方法不同，高秦等通過克隆化培養(yǎng)獲取牙周膜干細(xì)胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接篩選，不同的方法導(dǎo)致細(xì)胞所受外界條件刺激的不同，進(jìn)而可能影響到細(xì)胞周期的變化。

目前，學(xué)者們還未找到牙周膜干細(xì)胞的特異性表面抗原標(biāo)記物。Seo等[1]的研究結(jié)果顯示牙周膜干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原STRO-1及血管周圍細(xì)胞表面標(biāo)記物CD146及CD44。Nagatomo等[15]發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD105、CD166及STRO-1。Ivanovski等[16]發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞均無CD14、CD45和CD34表達(dá)。高秦等[10，21]研究結(jié)果顯示人牙周膜干細(xì)胞波形蛋白（Vimentin）及STRO-1呈陽性表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了表面抗原測定及免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示：Vimentin及STRO-l染色陽性，顯示其間充質(zhì)干細(xì)胞來源，此外，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD44及CD146在牙周膜干細(xì)胞中高表達(dá)，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34，造血系細(xì)胞標(biāo)記物CD45的表達(dá)極低，從正反兩方面證實(shí)了以往學(xué)者的結(jié)論。而多向分化研究結(jié)果也證實(shí)牙周膜干細(xì)胞可以經(jīng)誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，符合干細(xì)胞特征。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所篩選培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞為多角形、成纖維型細(xì)胞外觀，具備克隆形成能力及慢細(xì)胞周期特點(diǎn)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CD44、CD146、Vimentin、STRO-1，不表達(dá)CD34、CD45，均與文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，所培養(yǎng)細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)牙周膜干細(xì)胞具有多向分化能力。

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[收稿日期]2008-04-21[修回日期]2008-05-05

編輯/何志斌