瘢痕疙瘩ｐ５３基因檢測試劑盒的臨床應(yīng)用

[摘要]目的：在浙江地區(qū)對瘢痕疙瘩p53 基因檢測試劑盒進行臨床實驗， 評價此試劑盒的準確度和有效性。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-反向點雜交方法建立的試劑盒檢測了浙江地區(qū)75例瘢痕疙瘩患者與75例正常對照的p53基因第72位密碼子多態(tài)性位點的基因型。結(jié)果：瘢痕疙瘩組的Pro等位基因及Pro/Pro基因型頻率明顯高于對照組(P值分別為0.014、0.015)，Pro/Pro基因型者患瘢痕疙瘩的風(fēng)險性明顯增高(OR=2.404，95%CI:1.182～4.887)。結(jié)論：p53基因檢測試劑盒可以預(yù)測瘢痕疙瘩高危個體，對于臨床診斷和治療方面也有一定的指導(dǎo)意義，并具有良好的可重復(fù)性和特異性。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；p53基因；基因多態(tài)性檢測；試劑盒

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

The application of p53 gene detection kit for suscepbility of keloid

ZHUO Yang，GAO Jian-hua，ZENG Xing-ye，HUANG Da-dao，PAN Ruo-wang，CAO Xiao-en

(Department of Surgery，the 118th Hospital of PLA，Wenzhou 325000，Zhejiang，China)

Abstract： ObjectiveTo investigate the keloid testing box of p53 gene by clinic experiment and judge its validity and accuracy in Zhejiang Province，China.MethodsThe p53 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) that the kit adopt among 75 patients with keloid and 75 unrelated healthy controls from Zhejiang Province.ResultsThe frequency of the p53 Pro allele and the Pro/Pro genotype among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(P=0.014、0.015 respectively).The p53 Pro/Pro genotype significantly increased the risk for developing keloid，compared to the combination of Pro/Arg and Arg/Arg genotypes，with the odds ratio(OR) of 2.404(95%CI: 1.182～4.887).ConclusionThe p53 gene detection kit can be used to predicate high-risk individuals for keloid，it is useful to clinical diagnose and therapy effects monitoring.The keloid testing box is specific and valuable to repeated detection.

Key words：keloid;p53 gene;gene polymorphism detection;reagent kit

瘢痕疙瘩屬于病理性瘢痕，是由于結(jié)締組織對創(chuàng)傷的過度增生反應(yīng)而形成。研究結(jié)果提示瘢痕疙瘩成纖維細胞的過量增生和凋亡相對減少在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。p53基因是重要的細胞周期調(diào)節(jié)、凋亡基因，在多種腫瘤細胞中均可發(fā)現(xiàn)p53蛋白的聚集現(xiàn)象，并與p53基因突變或缺失有關(guān)[2]。隨著分子遺傳學(xué)的進展，了解遺傳因素在疾病中的作用將有利于疾病的診斷、治療和預(yù)防，也有助于了解環(huán)境因素在疾病發(fā)生中的作用。我們的前期工作已發(fā)現(xiàn)p53基因第72密碼子多態(tài)性與瘢痕疙瘩的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)關(guān)系，在此，我們在浙江地區(qū)應(yīng)用此試劑盒對瘢痕疙瘩臨床患者做相關(guān)檢查， 檢驗其有效性， 為臨床瘢痕疙瘩的預(yù)防和治療提供可靠的途徑。

1材料和方法

1.1 試劑盒組成（一個試劑盒可檢測10份樣品）

1.2需自備的儀器及試劑： PCR儀及分子雜交箱，2×SSC～0.1%SDS(20×SSC40ml，10%SDS 4ml，加H2O至400ml ，調(diào)pH至7.4)；0.5×SSC～0.1%SDS （20×SSC 5ml， 10%SDS 2ml， 加H2O至200ml，調(diào)pH至7.4）；0.1M檸檬酸鈉(檸檬酸鈉14.7g溶于450ml水，用濃HCl調(diào)pH至5.0， 最后定容至500ml)

1.3 p53基因特異性寡核苷酸(ASO)探針膜條制備過程

1.3.1 p53基因特異性寡核苷酸探針設(shè)計：應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計探針，氨基標記，探針序列分別為：NH2-5′-TGCTCCCCGCGTGGCCCCT-3′；NH2-5′-TGCTCCCCCCGTGGCCCCT-3′，由上海生工生物公司合成。

1.3.2 膜條制備：用打印機在硝酸纖維素膜上打印好標記格和編號。先用10%EDC（乙基二甲基氨基丙基碳二亞胺）浸泡膜條，充分處理10min，繼用蒸餾水洗數(shù)次，然后把膜條攤在濾紙或吸水紙上晾干。待干透后，取1μlASO點膜，反應(yīng)15min，再用0.1mol/L NaOH處理，晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標本來源：瘢痕疙瘩患者和正常對照人群均為浙江地區(qū)漢族居民。瘢痕疙瘩患者均經(jīng)本院臨床及病理診斷證實，共75例，其中男41例、女34例，年齡9～53歲，平均年齡26.8歲。本實驗采用隨機-對照研究， 正常對照組為有外傷史而非瘢痕體質(zhì)且無瘢痕疙瘩家族史的健康居民， 共75例， 兩匹配組間無血緣關(guān)系且無腫瘤病史， 其年齡、性別大致相同，用于基因檢測的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5操作步驟

1.5.1 待測樣品基因組DNA提取：采用北京賽百勝生物技術(shù)有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.5.2 PCR反應(yīng) 用于擴增p53基因第72位密碼子的引物5′端標記了非同位素檢測介質(zhì)Biotin，引物序列為：Bio-5′-GACCTGGTCCTCTGACTGCT-3′；Bio-5′-GATACGGCCAGGCATTGAAG-3′，由上海生工生物公司合成。反應(yīng)在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應(yīng)總體積中，含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環(huán)參數(shù)：95℃熱啟動4min后，95℃1min，68℃2min，35個循環(huán)后，72℃延伸5min。取3μl擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察結(jié)果(圖1)。

1.5.3 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產(chǎn)物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預(yù)熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉(zhuǎn)入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應(yīng)15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉(zhuǎn)入20ml顯色液[19ml0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/mlTMB]中避光顯色5～15min，期間觀察、記錄結(jié)果。

1.5.4 結(jié)果判定：雜交結(jié)束后膜條上格顯示藍紫色斑點為Pro/Pro基因型，中格顯示藍紫色斑點為Arg/Arg基因型，而上、中全部顯示為Pro/Arg基因型，下格為空白對照，不應(yīng)顯示斑點(圖2)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。單個基因型及組間等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，以Ｐ＜0.05為差異有顯著性意義，并以比值比(odds ratio，OR) 及其95%可信區(qū)間(confidenceinterval，CI) 表示相對風(fēng)險度。

2結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組的Pro等位基因頻率及Pro/Pro 基因型頻率明顯高于正常對照組(P值分別為0.014、0.015)。與Pro/Arg、 Arg/Arg基因型相比， Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風(fēng)險性(OR)明顯增高(OR=2.404，95%CI: 1.182～4.887)。

3討論

3.1 瘢痕疙瘩在一定程度上具有腫瘤的生物學(xué)特性，如生長迅速、侵潤正常組織和單純切除后易復(fù)發(fā)等特點。故一旦發(fā)生處理相當棘手，提前預(yù)測其可能發(fā)生的風(fēng)險率則可大大減少瘢痕疙瘩的發(fā)生，對其診斷和治療方面也有重要的臨床意義和實用價值。近年來，遺傳因素在許多疾病的發(fā)生中所起的重要作用備受重視，且已發(fā)現(xiàn)了多種易感基因的存在。p53基因即是目前較為關(guān)注的與瘢痕疙瘩疾病相關(guān)的基因之一。人類ｐ53基因定位于17q13.1，長約20Kb，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，編碼393個氨基酸，p53蛋白在細胞周期的調(diào)控、維持細胞基因組的完整性，誘導(dǎo)細胞分化和凋亡中起著重要的作用[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)p53基因第72位密碼子Pro/Arg多態(tài)與某些腫瘤易感性有關(guān)。Fan[5]等報道攜帶Pro/Pro純合基因型的美國白人患肺腺癌的風(fēng)險增加1.45倍，Zehbe等[6]的研究證實Arg/Arg純合基因型增加HPV感染宮頸癌的危險，最近， Kay等[7]報道p53 基因第72位密碼子多態(tài)性與體外受精和胚胎植入成功率相關(guān)。

3.2 我們在前階段發(fā)現(xiàn)p53基因第72密碼子多態(tài)性與瘢痕疙瘩的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)關(guān)系，Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風(fēng)險性明顯增高[8]，并以此設(shè)計并裝配成一套p53基因檢測試劑盒用于預(yù)測瘢痕疙瘩高危個體[9]，為檢驗試劑盒的有效性，我們通過對浙江地區(qū)75例瘢痕疙瘩患者p53 基因第72位密碼子多態(tài)性檢測， 發(fā)現(xiàn)Pro/Pro 基因型人群患瘢痕疙瘩的危險度較Pro/Arg 型和Arg/Arg 型高， Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風(fēng)險性(OR)明顯增高(OR=2.404，95%CI: 1.182～4.887)。此結(jié)果與先前報道的結(jié)論大致相同[8]， 我們認為此試劑盒可重復(fù)性良好、易于保存、操作過程既快速又經(jīng)濟， 適合在臨床普及使用。

3.3 在檢測過程中應(yīng)注意的問題

3.3.1 雜交溫度：反向點雜交的溫度要求非常嚴格，應(yīng)控制在42℃±0.5℃，否則就會影響雜交結(jié)果，雜交溫度一般低于DNA的解鏈溫度（T值）20℃～30℃，使用甲酰胺可降低T值，甲酰胺濃度增加1%，T值下降0.7℃，因此如果兩種不同的探針同時雜交，可以考慮用甲酰胺來調(diào)整解鏈溫度，使雜交順利進行。

3.3.2 雜交液的體積和雜交時間：雜交體系的體積小比大好，小體積有利于增加核酸與膜上探針雜合的機會，但也不能太小，太小也會影響探針的分子運動，與雜交不利，通常使用體積應(yīng)在60～100μl/cm2膜。對于雜交時間，3～24h不等，對于常用的雜交方法，往往取決于所用探針的濃度和強度，越高，雜交需要的時間越短，但過高的探針濃度既浪費又會使本底增高。本試劑盒所用的生物素標記的探針含量通常控制在20～1000ng/ml雜交液。

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[收稿日期]2008-01-22[修回日期]2008-04-23

編輯/張惠娟