ＨＧＦ／ｃ－ｍｅｔ蛋白在人增生性瘢痕組織中定位與表達(dá)的研究

[提要]目的：以肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-met蛋白為研究對象，研究其在人增生性瘢痕中的定位和表達(dá)。方法：采集住院患者的增生性瘢痕標(biāo)本，以免疫組織化學(xué)染色的方法檢測HGF/c-met在增生性瘢痕組織中的定位和表達(dá)，使用計算機輔助圖像分析技術(shù)比較真皮層HGF/c-met表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：在表皮層，增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的HGF/c-met均呈強陽性表達(dá)；相對于正常皮膚組織，人增生性瘢痕組織真皮層中HGF/c-met的表達(dá)明顯增加，特別是在真皮層的成纖維細(xì)胞中，差異顯著。結(jié)論：HGF/c-met在真皮層表達(dá)水平的改變可能是影響人增生性瘢痕形成的重要因素。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；肝細(xì)胞生長因子；免疫組織化學(xué)。

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）05-03

Experiment study of hepatocyte growth factor/c-met localization and expression in hypertrophic scar tissues

FENG Zhi，LI Shi-rong，CAO Chuan，WANG Zhen-xiang，CHEN Yan-qing，DAI Xia，XIA Shan

（Department of Plastic Surgery，Southwest Hospital，Third Millitary Medical University，Chongqing400038，China）

Abstract:ObjectiveHepatocyte growth factor（HGF） was investigated to study the localization and expression in hypertrophic scar tissues.MethodsAfter the hypertrophic scar tissues were obtained， immunohistochemistry was used to investgate the expression and location of HGF and c-met in pathologic sections. Computer-aid image analysis technology was used to detect quantitativly the change of the various protein expression.ResultsIn epidermis， HGF/c-met expression were intense staining.Compaired with normal skin tissues， HGF/c-met expression was up-regulated in hypertrophic scar tissues in dermic fibroblasts.ConlusionThe expression variance of HGF/c-met in derm could play an important role in the turnover of hypertrophic scar formation.

Key words：hypertrophic scar，hepatocyte growth factor，immunohistochemistry

增生性瘢痕( hypertrophic scar，HS) 是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致的皮膚纖維化疾病，目前其發(fā)病機制尚不清楚。肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）屬于Kringle蛋白家族，由一對69Da的α鏈和34Da的β鏈經(jīng)二硫鍵形成二聚體，通過與其受體c-met蛋白相結(jié)合，表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性[1]。動物實驗表明，HGF可以抑制肝臟TGF-β1的表達(dá)[2]，減弱小鼠肺纖維化模型中膠原的堆積[3]，改善傷口愈合后的形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]。

對多種纖維化類疾病的研究表明，血清中的HGF含量明顯增加[5-6]， c-met的表達(dá)還可以被HGF誘導(dǎo)增加[7]。但在人增生性瘢痕組織局部，HGF和c-met的表達(dá)是否改變至今仍不清楚。對此，本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法，結(jié)合計算機輔助圖像分析技術(shù)，試圖更詳細(xì)地了解在增生性瘢痕組織中，HGF和c-met的定位及其表達(dá)的變化，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1．主要材料和儀器：兔抗重組人HGF和兔抗人c-met多克隆抗體（武漢博士德公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG SABC免疫試劑盒（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），防脫玻片（Promega公司，美國），PBS及蘇木精襯染液（自制），Olympus熒光顯微鏡（Olympus，日本），Image Pro Plus v6.0圖像分析軟件（ABsoft公司，美國）。

1.2．方法

1.2.1．標(biāo)本的選擇：選擇5例臨床診斷為增生性瘢痕的患者，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)參見李世榮主編的《現(xiàn)代整形美容外科學(xué)》，患者無系統(tǒng)性疾病，病程為傷后3～6個月，常規(guī)消毒后切取增生性瘢痕中央部位，另選擇5例正常皮膚組織，來自于本科室手術(shù)患者供皮區(qū)全厚皮，標(biāo)本大小均約1cm×1cm×0.5cm。

1.2.2．免疫組織化學(xué)SABC法染色：將上述標(biāo)本即刻投入4%多聚甲醛中浸泡，48h后石蠟包埋并切片，貼片后微波修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，加入羊血清封閉非特異性抗原，分別加入一抗（兔抗重組人HGF單克隆抗體和兔抗人c-met單克隆抗體，均稀釋為1∶100）4℃過夜，依試劑盒說明書要求，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG單克隆抗體，均稀釋為1∶200），振洗后依次加入ABC復(fù)合劑、Tris-HCl緩沖液、底物顯色液，并以蘇木精染液行核襯染并封片；陽性對照選擇已知表達(dá)HGF和c-met的肝細(xì)胞肝癌病理切片，陰性對照選擇小牛血清。

1.2.3．計算機輔助圖像分析：機型為Lenovo Sunrise 120筆記本電腦，顯卡驅(qū)動為INTEL EXTREME GRAPHICS 6.14.10.3553版，操作系統(tǒng)為WindowsTMXPSP2。兩位獨立的研究人員檢測陽性表達(dá)，每張切片隨機選擇3個真皮層視野，每組共計15個放大400倍的視野，依照Image-ProPlus v6.0圖像分析軟件的使用說明，分別測量各組真皮層細(xì)胞HGF和c-met陽性表達(dá)的累計光密度（Integrated optical density，IOD）。

1.2.4．統(tǒng)計方法：所用實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1 c-met的表達(dá)和定位：表達(dá)c-met蛋白的細(xì)胞胞漿被染為棕黃色。在表皮層，染色陽性的表皮細(xì)胞呈多角形，并和周圍細(xì)胞相互嵌合，具有表皮細(xì)胞的形態(tài)特征。而在真皮層中，c-met染色陽性的細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞，呈梭形或不規(guī)則形；另外可在汗腺、毛囊上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中看到陽性表達(dá)。正常皮膚和增生性瘢痕組織的c-met表達(dá)均主要位于表皮層，可見強陽性表達(dá)，而真皮層相對少；其中，正常皮膚組織真皮層幾乎觀察不到c-met表達(dá)陽性的細(xì)胞，而增生性瘢痕組織中，可見中等強度陽性表達(dá)的細(xì)胞。詳見圖1。

2.2 HGF的表達(dá)和定位：陽性HGF的細(xì)胞同樣被染為棕黃色。HGF陽性表達(dá)的細(xì)胞和c-met陽性表達(dá)的細(xì)胞分布情況十分相似。正常皮膚和增生性瘢痕組織的HGF表達(dá)均主要位于表皮層，可見強陽性表達(dá)，而真皮層相對少；其中，正常皮膚組織真皮層幾乎觀察不到HGF陽性的細(xì)胞，而增生性瘢痕組織中，可見中等強度陽性表達(dá)的細(xì)胞。詳見圖2。

2.3 計算機輔助圖像分析系統(tǒng)測量各組切片IOD的結(jié)果：使用Image-Pro Plus 6.0軟件對兩組切片真皮層HGF/c-met陽性表達(dá)的IOD進行分析，可以看到相比較于正常皮膚組，增生性瘢痕組織的HGF和c-met的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），其中HGF的升高幅度更加明顯，超過了7.5倍。各組的數(shù)據(jù)繪制統(tǒng)計表1。

3討論

目前已知，HGF可在包括肝臟在內(nèi)的多種器官廣泛表達(dá)，通過與具有酪氨酸激酶活性的受體c-met蛋白結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，發(fā)揮其促上皮細(xì)胞有絲分裂、運動變形、及形態(tài)塑構(gòu)等多種生物學(xué)效應(yīng)。皮膚組織中，HGF主要由表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成、分泌，通過旁分泌和自分泌的方式作用于自身及臨近的細(xì)胞。HGF對c-met的表達(dá)具有正反饋作用，即HGF可以刺激其受體c-met的表達(dá)。

近年來，眾多的動物實驗表明，HGF是一種關(guān)鍵的抗纖維化疾病的內(nèi)源性生長因子[3-5，8-10]。哈小琴等[11]通過使用重組的腺病毒AD-HGF處理兔耳創(chuàng)傷模型，發(fā)現(xiàn)瘢痕增生明顯減輕。Ono等[12]則發(fā)現(xiàn)HGF基因轉(zhuǎn)染治療創(chuàng)口，可以抑制成纖維細(xì)胞的凋亡、促進血管增生，進而改善瘢痕的組織形態(tài)。但是目前在增生性瘢痕病程的轉(zhuǎn)歸過程中，對組織局部微環(huán)境HGF/c-met的表達(dá)和定位仍缺乏了解。增生性瘢痕的主要特征是真皮結(jié)構(gòu)的改變，其病理生理過程和成纖維細(xì)胞功能改變密切相關(guān)。本研究表明，和正常皮膚組織比較，在增生性瘢痕組織真皮層成纖維細(xì)胞HGF/c-met的表達(dá)均增強，其中，HGF的增強幅度更明顯。HGF的表達(dá)受到多種因素的影響，包括IL-1、TNF-α、PDGF、EGF和缺氧等可以上調(diào)HGF的表達(dá)，而TGF-β1則可以下調(diào)HGF的表達(dá)；而c-met蛋白則可以被HGF、EGF、IL-1和甾體類激素誘導(dǎo)表達(dá)[13]。

考慮到HGF的多種生物學(xué)功能，這表明HGF通過結(jié)合受體c-met，在增生性瘢痕病程的轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。但對于這一現(xiàn)象仍需要深入的研究，因為和上述文獻(xiàn)動物實驗不同，這種高表達(dá)HGF和c-met似乎并沒有使標(biāo)本供體的臨床表現(xiàn)消失或減輕。對此，我們推測可能有多種原因，包括增生性瘢痕發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機制、HGF/c-met下游產(chǎn)物的生物活性和增生性瘢痕組織局部微環(huán)境的改變。此外，上述文獻(xiàn)中動物模型的建立、HGF的作用劑量和途徑等因素也有別于本研究所采集的臨床標(biāo)本，這些問題有待于更多的研究來揭示和證實。

總之，本研究的結(jié)果表明，HGF/c-met在增生性瘢痕和正常皮膚組織中均有表達(dá)，陽性細(xì)胞主要位于表皮層；而相比較與正常皮膚組織，在增生性瘢痕組織真皮層成纖維細(xì)胞表達(dá)HGF上調(diào)，并可能由此誘導(dǎo)其受體c-met表達(dá)升高。這種真皮層HGF/c-met表達(dá)水平的改變，提示了其在增生性瘢痕的疾病轉(zhuǎn)歸過程中可能發(fā)揮了重要作用。本研究為更好的了解HGF/c-met在增生性瘢痕中的作用打下了相應(yīng)的基礎(chǔ)，通過更加深入的研究，相信HGF/c-met可以為防治瘢痕類疾病帶來新的研究方向和思路。

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[收稿日期]2008-02-23[修回日期]2008-05-06

編輯/張惠娟