ＲＮＡ干擾對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞ＣＴＧＦ表達(dá)和膠原合成的影響

[摘要]目的：研究結(jié)締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）siRNA表達(dá)載體對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Human keloid fibroblasts，HKFs）中CTGF表達(dá)、膠原蛋白分泌的影響。方法：根據(jù)RNA干擾(RNA interference， RNAi)設(shè)計原則，設(shè)計并構(gòu)建特異性CTGF siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)HKFs。用熒光實(shí)時定量PCR分析細(xì)胞中CTGF mRNA表達(dá)水平，3H-脯氨酸摻入法測定細(xì)胞膠原蛋白分泌水平。結(jié)果：與質(zhì)粒組和對照組比較， CTGF siRNA表達(dá)載體組的CTGF mRNA表達(dá)降低約59.9%（P＜0.05），膠原蛋白分泌明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論： CTGF siRNA表達(dá)載體能明顯抑制HKFs中CTGF表達(dá)及膠原蛋白分泌水平，有可能成為臨床上治療瘢痕疙瘩的新方法。

[關(guān)鍵詞]基因療法；結(jié)締組織生長因子；人瘢痕成纖維細(xì)胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

Impact of RNAi on CTGF expression and collagen secretion in HKFs

ZHAO Ping，LI Shi-rong

（Department of Plastic Surgery， Southwest of Third Military Medical University， Chongqing400038，China）

Abstract:ObjectiveTo study the effect of the constructed vecrors expressing siRNA of connective tissue growth factor(CTGF) on CTGF mRNA level and collagen secretion in HKFs.MethodsVectors expressing CTGF siRNA were designed， constructed andtransfected into HKFs. The real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）was performed to detect CTGFmRNA level. The collagen secretion was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsThe CTGFmRNA level and the collagen secretion of vecrors group were markedly lower than those of plasmids group（both P＜0.05）.ConclusionVectors expressing CTGF siRNA can inhibit CTGFmRNA level and the collagen secretion in HKFs. This may be a new way to treat keloid.

Key words: gene therapy；Connective tissue growth factor(CTGF)；HKFs

瘢痕疙瘩（Keloid KD）是皮膚損傷如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)后引發(fā)的以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的過度瘢痕化。其發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，常嚴(yán)重毀損患者容顏，引發(fā)功能障礙，是整形外科領(lǐng)域的治療重點(diǎn)和難點(diǎn)。CTGF是一種重要的促纖維化因子，通過TGF/SMADs途徑參與病理性瘢痕的形成，阻斷CTGF的產(chǎn)生及其促纖維化效應(yīng)可能為今后病理性瘢痕的治療提供了一個新的靶點(diǎn)[1]。本研究旨在構(gòu)建CTGF siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HKFs中，觀察其對細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)和膠原蛋白分泌的影響，并探討有關(guān)機(jī)制，為臨床上防治瘢痕疙瘩提供新的途徑。

1資料和方法

1.1 主要試劑：質(zhì)粒pGenesil-1（武漢晶賽生物公司），Dosper脂質(zhì)體（Roche，德國），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國），Trizol試劑、SYBRGreenⅠ熒光染料、RT-PCR試劑盒(Invitrogen，美國)，3H-脯氨酸（上海原子能研究所）。

1.2 CTGF siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：根據(jù)RNAi設(shè)計原則，用生物信息學(xué)方法在GeneBank中找到CTGF基因編碼序列(登錄號:NM_001901)，選擇編碼區(qū)內(nèi)以起始密碼ATG后100bp始至終止密碼前100bp止的一段序列作為候選區(qū)，輸入在線設(shè)計網(wǎng)站http://www.ambion.com，尋找出的序列再經(jīng)BLAST比對。最后將篩選出的3條序列分別設(shè)計3對64nt寡核苷酸，送上海生工合成。每條寡核苷酸包括：兩端用于形成酶切位點(diǎn)（BamHI和HindIII）的序列，作為終止信號的5個胸嘧啶核苷(T)，兩個反向互補(bǔ)排列的21ntCTGF特異性序列由一個9nt的間區(qū)隔開，用于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。將寡核苷酸退火結(jié)合形成雙鏈，將環(huán)狀質(zhì)粒pGenesil-1用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠回收大片段。將退火片段與線性化載體進(jìn)行連接，構(gòu)建CTGF siRNA表達(dá)載體，酶切及測序鑒定正確后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選出抑制效率最高的靶序列AAAGTGCATCCGTACTCCCAA。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：選用瘢痕疙瘩患者（診斷標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[2]）術(shù)中切除的瘢痕組織，于無感染及潰瘍處取材，組織法分離HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃ 5%CO2，待細(xì)胞融合后，0.25%胰酶溶液消化并按1:3傳代，傳代后細(xì)胞均勻接種，取體外培養(yǎng)第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4基因轉(zhuǎn)染

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組：對照組:單純DMEM培養(yǎng)基+脂質(zhì)體；空質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1空質(zhì)粒；表達(dá)載體組：轉(zhuǎn)染CTGF siRNA表達(dá)載體。

1.4.2基因轉(zhuǎn)染

1.4.2.1 制備空質(zhì)粒（表達(dá)載體）+脂質(zhì)體復(fù)合物：采用無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋空質(zhì)粒（表達(dá)載體）和Dosper脂質(zhì)體，室溫下靜置30min后等量混勻形成復(fù)合物。

1.4.2.2 轉(zhuǎn)染：用0.25%胰酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以3×106/ml的密度接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶孔板。在37℃ 5%CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合時根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時相點(diǎn)。

1.5HKFs中CTGFmRNA的測定

1.5.1 總RNA提?。菏占?xì)胞，以Trizol試劑提取總RNA，于波長260、280nm處測定吸光度（A）值，計算核酸純度A260/A280為1.8～2.0，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)條件為30℃10min、60℃25min、99℃5min、5℃ 5min。

1.5.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測：Primer5.0軟件設(shè)計CTGF引物序列，正向?yàn)?'-CCCGCAGTGCCAACCATGAC -3'，反向?yàn)?'-GCAGCCGCAGCCGTCCAG-3'，擴(kuò)增片段長度為184bp；內(nèi)參三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物序列正向?yàn)?'-CGCGGGGCTCTCCA -GAACAT-3'，反向?yàn)?'-CTCCGACGCCTGCTTCACCA-3'，擴(kuò)增片段長度為204bp。反應(yīng)過程為94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循環(huán)28次，72℃延伸10min。SYBRGreenⅠ熒光染料技術(shù)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，同樣樣本做3復(fù)管，ABI7500 熒光定量PCR儀檢測，計算機(jī)分析ΔCt值:每個反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到系統(tǒng)所能檢測到的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)-內(nèi)參的循環(huán)數(shù)。

1.6 HKFs的膠原含量的測定：于各組細(xì)胞中加入含有0.5μCi的H3-脯氨酸溶液10μl，維生素C、β氨基丙啨混合液100μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。以多頭細(xì)胞收集器收集樣本并干燥，經(jīng)閃爍液處理后送液體閃爍計數(shù)儀檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包，實(shí)驗(yàn)計量結(jié)果采用以x±s表示。

2結(jié)果

2.1 CTGF siRNA表達(dá)載體對HKFs中CTGFmRNA表達(dá)的影響：定量結(jié)果顯示，表達(dá)載體組的CTGFmRNA表達(dá)含量較空質(zhì)粒組減少約59.9%（P＜0.05）；對照組和質(zhì)粒組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 CTGF siRNA表達(dá)載體對HKFs膠原分泌的影響：表達(dá)載體組對HKFs的膠原分泌較空質(zhì)粒組和對照組有明顯抑制作用（P＜0.05），質(zhì)粒組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（△P＞0.05）。見表2。

3討論

RNA干擾是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，即mRNA被結(jié)合后即被降解或被相應(yīng)的反義RNAP蛋白質(zhì)封閉，從而阻止mRNA修飾和翻譯，這種RNA水平的基因調(diào)控比轉(zhuǎn)錄水平基因沉默現(xiàn)象更普遍[3]，具有特異性、高效性和方便性等顯著特點(diǎn)。Takabatake等[4]就證明RNA干擾抑制基因表達(dá)的效果比反義寡核苷酸技術(shù)效率高1000倍以上。

人GTGF屬于CNN（即刻早期基因）家族成員，其生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和增生，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附和凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成，誘導(dǎo)血管形成、軟骨骨化和促進(jìn)胚胎發(fā)育等諸多方面[5]。在皮膚纖維化方面，Colwell等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)比正常皮膚組織中提高約20倍，并且經(jīng)TGF-β1刺激后，CTGF的表達(dá)可提高100倍以上，認(rèn)為TGF-β1可能通過CTGF表達(dá)的提高促使瘢痕疙瘩的形成，而阻斷CTGF的活性則可以減少病理性瘢痕的發(fā)生。而劉劍毅等[7]在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的硫代磷酸化CTGF反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HKFs中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTGF反義寡核苷酸能夠抑制HKFs的CTGF mRNA的表達(dá)和膠原合成。

許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)通過靶向抑制CTGF從而抑制纖維化的發(fā)生發(fā)展是理論上抗纖維化的有效形式，由于siRNA表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染后可進(jìn)行瞬時或穩(wěn)定的基因沉默，因此相較于化學(xué)合成更有應(yīng)用價值。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了特異性的CTGF siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入瘢痕成纖維細(xì)胞。證實(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的瘢痕成纖維細(xì)胞的CTGFmRNA表達(dá)水平顯著降低，與空質(zhì)粒組相比，抑制效果十分明顯，膠原蛋白分泌量相比也明顯減少。提示莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)的CTGF siRNA表達(dá)載體可在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割自動加工成為siRNA分子， 特異性地與CTGFmRNA相結(jié)合， 降解CTGFmRNA，引發(fā)基因沉默或表達(dá)抑制，同時導(dǎo)致細(xì)胞外膠原分泌降低。這可能為臨床上治療瘢痕疙瘩提供了新方法。

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[收稿日期]2008-02-13[修回日期]2008-04-20

編輯/張惠娟