骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)豚鼠皮膚光老化治療作用的研究

[摘要]目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）皮膚光老化的修復(fù)作用，為皮膚光老化的治療提供新的治療途徑。方法：UVA，UVB紫外線燈同時(shí)照射豚鼠，每天2h，連續(xù)照射50天，制備皮膚光老化模型；紫外線照射2周后，在豚鼠皮膚照射區(qū)，局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射DAPI標(biāo)記的第3代豚鼠BMSCs 0.8ml（1×105個(gè)/ml），每周一次。注射后24h、5天及10天觀察豚鼠皮膚變化，同時(shí)取照射區(qū)的皮膚制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記的BMSCs在紫外線照射區(qū)皮膚組織內(nèi)的遷徙及定居情況。結(jié)果：與對(duì)照組相比，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現(xiàn)皺紋，皮膚松弛、修復(fù)性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀；BMSCs治療組在治療前出現(xiàn)的癥狀與未治療組相同，治療后上述癥狀逐漸消失，未出現(xiàn)色素沉著。激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現(xiàn)在真皮層；注射后5天BMSCs出現(xiàn)在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質(zhì)層。結(jié)論：BMSCs對(duì)皮膚光老化有明顯的延緩及修復(fù)作用。

[關(guān)鍵詞]皮膚光老化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）05-03

Research of bone marrow mesenchymal stem cells curing photoaging of guinea pig skin

YAO Chun-li，SU Guan-fang

(Department of Laser Cosmetics and Plastic Surgery ofthe 2rd Hospital of Jilin University， Jilin 130041， Changchun，China)

Abstract：ObjectiveTo research bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) curing photoaging of guinea pig skin to provide a new way of curing skin photoaging.MethodsIrradiated guinea pigs 2 hours per day for 50 days using UVA and UVB ultraviolet radiator to establish skin photoaging model.After 2 week radiation executed multiple intradermal injections of the third-generation BMSCs(0.8ml，1×105/ml) marked by DAPI into the ultraviolet radiation area of guinea pig skin every week.Observed the skin 24h，5d and 10d after injection，and maked frozen section from the ultraviolet radiation area of guinea pig skin.Observed migration and ecesis of the BMSCs marked by DAPI in ultraviolet radiation area of guinea pig skin by laser scanning confocal microscope.ResultsCompared with control group，skin photoaging symptoms of the no-treatment group increased with irraditive time，wrinkles， cutis laxa，scurf reparativethickening，pigment deposition and leather appearance appeard.The same symptom of the treatment group gradually dissappered and no pigment deposition appeard in the treatment group.Using laser scanning confocal microscope the BMSCs marked by DAPI were observed appearing in dermis 24h after the injection，appearing in dermis，hair follicle，etc，5d after the injection，becoming dispersedly distributed in the entire layers of the skin including stratum corneum 10d after the injection.ConclusionBMSCs could obviously delay and cure skin photoaging.

Key words: skin photoaging; bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);laser scanning confocal microscope

Ei-Domyati M等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在日光保護(hù)部位，皮膚Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原只有到80歲以后才表現(xiàn)出減少，但在日光曝露部位10歲時(shí)已減少20%左右，到90歲時(shí)減少50%左右，而且曝露部位的膠原纖維結(jié)構(gòu)在40歲后出現(xiàn)紊亂。而Fathke C[2]研究證實(shí)，損傷的皮膚是BMSCs的靶組織，BMSCs能夠縮短I型和III型膠原的轉(zhuǎn)錄，BMSCs治療皮膚創(chuàng)傷的作用比公認(rèn)的CD45+細(xì)胞亞群的作用更大。但BMSCs用于治療皮膚光老化未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究在皮膚光老化模型豚鼠紫外線照射區(qū)皮內(nèi)局部注射DAPI標(biāo)記的BMSCs，觀察BMSCs細(xì)胞在光老化皮膚內(nèi)遷徙、定居以及對(duì)光老化組織的修復(fù)作用，為皮膚光老化的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：DMEM（ScienCell，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），二甲基亞砜、DAPI（Sigma公司，美國(guó)）；倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），15W UV-A和UV-B紫外燈（上海晨辰照明電器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：健康雌性白色豚鼠，體重（220±20）g，30只，購(gòu)自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。皮膚光老化模型豚鼠20只，隨機(jī)分為2組：未治療組（單純紫外線照射），治療組（紫外線照射2周后，局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.8ml豚鼠BMSCs （1×105個(gè)/ml），每周一次）。另取正常豚鼠作為對(duì)照。BMSCs注射后24h、5天、10天，觀察BMSCs對(duì)紫外線照射區(qū)皮膚的治療作用。

1.3 皮膚光老化動(dòng)物模型的建立：用剪毛剪剪除5cm×5cm區(qū)域的豚鼠背部毛，將15w UV-A和UV-B紫外燈并列置于豚鼠背部裸露皮膚區(qū)正上方35cm處，每天照射2h，每天用剃須刀剔除新長(zhǎng)出的豚鼠毛，觀察豚鼠皮膚變化。

1.4 豚鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)：處死豚鼠乳鼠，75%酒精浸泡，無(wú)菌條件下取股骨和肱骨，用DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞。加入等體積的percoll分離液，1500r/min離心20min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層加入DMEM培養(yǎng)液，1 200r/min離心8min，洗滌細(xì)胞，反復(fù)2次。計(jì)數(shù)，以(4±2)×106個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每周換液2次。待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，傳到3代備用。

1.5 DAPI標(biāo)記的BMSCs對(duì)豚鼠皮膚光老化的治療：稱(chēng)取DAPI 5.0mg，溶于1.427ml二甲基亞砜（DMSO）中，再加入713ml DMEM，混勻，作為DAPI應(yīng)用液備用。收集培養(yǎng)第3代的豚鼠BMSCs，用DMEM洗滌2次，加入DAPI應(yīng)用液10ml/瓶，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，1h后，棄去DAPI應(yīng)用液，用DMEM洗滌2次，加入含15％胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。24h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，確認(rèn)標(biāo)記成功后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。紫外線照射2周后，在豚鼠皮膚照射區(qū)局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.8ml上述細(xì)胞。注射后24h、5天、10天觀察照射區(qū)皮膚變化，并處死豚鼠，取紫外線照射區(qū)的皮膚制備冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記的BMSCs的分布。

2結(jié)果

2.1 BMSCs對(duì)豚鼠皮膚光老化的治療作用：在豚鼠紫外線照射區(qū)，局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射DAPI標(biāo)記的第3代豚鼠BMSCs，肉眼觀察可見(jiàn)，對(duì)照組皮膚無(wú)明顯變化；與對(duì)照組相比，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現(xiàn)皺紋，皮膚松弛、修復(fù)性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀（圖1）；BMSCs治療組在治療前出現(xiàn)的癥狀與未治療組相同，治療后皺紋、皮膚松弛、修復(fù)性增厚、皮屑等癥狀逐漸消失，未出現(xiàn)色素沉著（圖2）。

2.2 DAPI標(biāo)記的BMSCs在紫外線照射區(qū)豚鼠皮膚組織內(nèi)的遷徙和定居：將DAPI標(biāo)記的BMSCs經(jīng)皮膚紫外線照射區(qū)局部多點(diǎn)皮內(nèi)注入后，取紫外線照射區(qū)的皮膚制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現(xiàn)在真皮層；注射后5天BMSCs出現(xiàn)在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質(zhì)層，如圖3示。

3討論

BMSCs具有：①來(lái)源相對(duì)廣泛、取材方便；②低免疫源性，并可進(jìn)行自體移植，大大降低了免疫排斥危險(xiǎn)；③易于擴(kuò)增（MSC可擴(kuò)增達(dá)20代[3-4]）；④具有良好的可塑性，在損傷信號(hào)的誘導(dǎo)下能夠分化為各種神經(jīng)細(xì)胞；⑤具有對(duì)病變部位的“趨化性”等優(yōu)點(diǎn)。因此被用于治療皮膚損傷。大量研究結(jié)果表明，BMSCs在皮膚損傷中的應(yīng)用都取得了理想效果，含有BMSCs 的組織工程皮膚移植后促進(jìn)了燒傷創(chuàng)面的愈合[5]，復(fù)合BMSCs的組織工程真皮移植后，提高了愈合速度，獲得了較理想的創(chuàng)面愈合效果[6]。但是應(yīng)用BMSCs治療皮膚光老化未見(jiàn)報(bào)道。皮膚光老化是皮膚衰老的一部分，對(duì)其預(yù)防與治療，可以提高人們的生命質(zhì)量。

因此，本研究模擬自然光線，建立豚鼠皮膚光老化模型，研究BMSCs對(duì)皮膚光老化的作用，以探索預(yù)防與治療皮膚光老化的新途徑。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現(xiàn)皺紋，皮膚松弛、修復(fù)性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀；BMSCs治療組在治療前出現(xiàn)的癥狀與未治療組相同，治療后，皺紋、皮膚松弛、修復(fù)性增厚、皮屑等癥狀逐漸消失，未出現(xiàn)色素沉著。激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現(xiàn)在真皮層；注射后5天BMSCs出現(xiàn)在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質(zhì)層。結(jié)果提示BMSCs延緩皮膚光老化，對(duì)皮膚光老化有修復(fù)作用。BMSCs對(duì)皮膚光老化治療作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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[收稿日期]2008-01-09[修回日期]2008-03-15

編輯/張惠娟