隸屬度法優(yōu)化黑順片炮制工藝研究

王 涵， 高盼盼， 李 天， 許璐璐， 張辰露

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

附子為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，是典型的毒性中藥，具有回陽(yáng)救逆、散寒止痛的功效[1]。臨床使用前必須經(jīng)過(guò)特定工藝炮制，將毒性較強(qiáng)的雙酯型生物堿DDAs水解生成毒性較低的單酯型生物堿MDAs[2]，目前臨床使用的附子飲片多以黑順片為主。漢中是國(guó)內(nèi)附子的主產(chǎn)區(qū)之一，其種植歷史已有300余年，且種植規(guī)模居全國(guó)前列，但附子炮制加工依然存在諸多問(wèn)題[3]，例如隨意變更蒸煮時(shí)間使附子飲片加工不足或過(guò)度，導(dǎo)致藥效成分含量過(guò)高或過(guò)低；重膽浸泡，導(dǎo)致飲片灰分超標(biāo)等，嚴(yán)重影響了漢中附子飲片的整體品質(zhì)[4]。歷版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄了黑順片炮制過(guò)程為“取泥附子按大小洗凈浸入膽巴的水溶液數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，切片，水漂，蒸至油面，烘干”。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]中雖然增加了灰分檢測(cè)指標(biāo)，但對(duì)浸膽時(shí)間、蒸煮時(shí)間、漂水時(shí)間等具體工藝步驟仍未明確操作規(guī)范[5]。因此，本文采用正交試驗(yàn)與隸屬度法評(píng)價(jià)對(duì)黑順片炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，為附子飲片產(chǎn)地加工實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

附子藥材由陜西華克生物醫(yī)藥有限公司提供，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院周天華博士鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭的子根。將新鮮的泥附子去掉須根，清洗干凈，從中取1份趁鮮切0.5 cm片，干燥制成生附片，作為對(duì)照組。

1.1.2 主要試劑

苯甲酰新烏頭原堿BMA(批號(hào)：19032406，純度≥99.73%)，苯甲酰烏頭原堿BAC(批號(hào)：18110710，純度≥98.99%)，苯甲酰次烏頭原堿BHA(批號(hào)：19032807，純度≥99.66%)，新烏頭堿MA(批號(hào)：18111001，純度≥98.12%)，烏頭堿AC(批號(hào)：18110905，純度≥98.01%)，次烏頭堿HA(批號(hào)：18111308，純度≥99.04%)，以上對(duì)照品均購(gòu)于北京儀化通標(biāo)科技有限公司。超純水(儀器)，乙腈、甲醇、二乙胺為HPLC級(jí)，鹽酸、氨水為分析級(jí)，膽巴。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Thermo Fisber Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，ME104E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SHZ-95B循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠)，德國(guó)IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限公司)，Q-300DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG-9145電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，UPH-11-20T超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黑順片的炮制

附子2019年7月購(gòu)于陜西漢中南鄭區(qū)胡家營(yíng)附子生產(chǎn)基地，在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[6]中黑順片加工基本流程基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化。按照泥附子個(gè)頭大小，挑選出同一等級(jí)的新鮮泥附子作為試驗(yàn)材料，去除殘莖及毛根，清洗，浸泡于3 mol/L膽巴液中數(shù)日，之后按照煮制、切片、漂片、蒸制、烘干的基本流程處理。

1.2.2 酯型生物堿的含量測(cè)定

1.2.2.1 供試樣品溶液的制備

精密稱取生附子及黑順片炮制品粉末(過(guò)三號(hào)篩)2.00 g，平行稱取3份，置具塞錐形瓶中，加氨試液(體積分?jǐn)?shù)40%氨水)2 mL，精密加入乙醚50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，用乙醚補(bǔ)足揮發(fā)的重量，過(guò)濾。精密量取濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，加入體積分?jǐn)?shù)0.05%鹽酸甲醇混合溶液3 mL溶解，待殘?jiān)耆芙夂笥?.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液，即為供試品溶液，備用[7]。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA對(duì)照品，精密稱量，加入體積分?jǐn)?shù)0.05%鹽酸-甲醇混合溶液制成混合對(duì)照品母液。其中BMA濃度為1.08 mg/mL、BAC濃度為1.06 mg/mL、BHA濃度為0.80 mg/mL、MA濃度為1.07 mg/mL、AC濃度為1.06 mg/mL、HA濃度為0.98 mg/mL。分別吸取0.5、0.2、0.2、0.5、0.2、0.5 mL定容至10 mL制成混合對(duì)照品溶液①，再精密吸取混合對(duì)照品溶液①1 mL，加體積分?jǐn)?shù)0.05%鹽酸-甲醇溶液稀釋至10 mL，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液②。混合對(duì)照品溶液①和混合對(duì)照品溶液②分別上樣檢測(cè)，設(shè)置梯度進(jìn)樣量。

1.2.2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以體積分?jǐn)?shù)3 ‰二乙胺為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～30 min，體積分?jǐn)?shù)25%～45% A；30～40 min，體積分?jǐn)?shù)45%～55% A；40～50 min，體積分?jǐn)?shù)55%～65%A；50～60 min，體積分?jǐn)?shù)65%～75% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5000，分離度>1.5。

1.2.2.4 樣品測(cè)定

取已知濃度的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按照1.2.2.3項(xiàng)下色譜分析條件測(cè)定生附子及黑順片炮制品中6種主要生物堿BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA的含量。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中這6種酯型生物堿含量。

1.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液①各3、5、10、15、20 μL和混合對(duì)照品溶液②各2、3、5、10、15 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。以6種生物堿對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程及其線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6種酯型生物堿線性范圍及線性關(guān)系

1.2.4 附子炮制工藝正交試驗(yàn)

在黑順片傳統(tǒng)炮制工藝(洗凈、浸膽、煮透、水漂、切片、蒸透、烘透)的基礎(chǔ)上，考察選取了4個(gè)關(guān)鍵工藝因素，設(shè)置3個(gè)水平，因素水平見(jiàn)表2。取相同大小等級(jí)的新鮮泥附子樣品9份，每份約1 kg，設(shè)置3次平行，按照L9(43)正交表進(jìn)行炮制處理，進(jìn)行黑順片炮制工藝優(yōu)化研究。

表2 黑順片炮制工藝正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取附子樣品約4.00 g，參照文獻(xiàn)[8]灰分測(cè)定法對(duì)試驗(yàn)樣品的總灰分、酸不溶性灰分指標(biāo)進(jìn)行考察,每個(gè)樣品設(shè)置3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 附子中6種酯型生物堿對(duì)照品和樣品的HPLC圖

分別取生附子及黑順片樣品，按1.2.2.1項(xiàng)下分別處理，得到供試品溶液，并取1.2.2.2項(xiàng)下附子6種酯型生物堿對(duì)照品混合液，按照1.2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

(b)生附子

(c)黑順片1.BMA； 2.BAC； 3.BHA； 4.MA； 5.AC； 6.HA圖1 附子生物堿對(duì)照品和供試品的HPLC圖

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

作為毒性藥材，附子飲片的品質(zhì)評(píng)價(jià)具有復(fù)雜性和不確定性的特點(diǎn)。本研究采用多維模糊綜合評(píng)判方法(隸屬度法)對(duì)黑順片質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隸屬度法是針對(duì)受多種因素影響的事物做出全面評(píng)價(jià)的一種十分有效的多因素決策方法[9]。對(duì)于欲達(dá)到最大值的指標(biāo)(如MDAs總含量和外觀評(píng)分)，其指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)；對(duì)于限量指標(biāo)(如DDAs總含量)，其指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)最大值-指標(biāo)值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)。指標(biāo)最大值的隸屬度為1，而限量指標(biāo)的隸屬度為0，所以0≤指標(biāo)隸屬度≤1[10]。為保障黑順片的安全性和有效性，在提高單酯型生物堿總含量與降低雙酯型生物堿總含量的同時(shí)，還要避免過(guò)度加工導(dǎo)致雙酯型生物堿完全消失，同時(shí)飲片品質(zhì)評(píng)價(jià)也需考慮飲片外觀性狀指標(biāo)[11]。因此本研究以飲片傳統(tǒng)外觀性狀、單酯型生物堿總含量及雙酯型生物堿總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值作為參照，對(duì)同一指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。權(quán)重比例為單酯型生物堿總含量占50%，雙酯型生物堿總含量占35%，外觀評(píng)分占15%，綜合評(píng)分=單酯型生物堿總含量評(píng)分×50%+雙酯型生物堿總含量評(píng)分×35%+炮制品外觀評(píng)分×15%，滿分為1.00[12]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

黑順片外觀性狀評(píng)分評(píng)價(jià)方法參照林華等的方法[10]，滿分為10分。“黃褐色發(fā)亮”“質(zhì)地實(shí)、酥脆斷面光澤”“氣微，無(wú)麻舌感”(10分)；“黃褐色”“質(zhì)地實(shí)、較為酥脆斷面較有光澤”“氣微，微有麻舌感”(7分)；“皮部褐色、木質(zhì)部為黃白色”“質(zhì)較堅(jiān)實(shí)、略呈粉性斷面略有光澤”“氣微，有麻舌感”(5分)；“黃白色”“質(zhì)硬、呈粉性斷面粗糙”“氣微，麻舌感強(qiáng)烈”(1分)。

由表3和表4結(jié)果可知，影響黑順片質(zhì)量的因素主次順序?yàn)锳(浸膽時(shí)間)>D(蒸制時(shí)間)>C(漂片次數(shù))>B(煮制時(shí)間)；其中浸膽時(shí)間、蒸制時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24 h內(nèi)漂片次數(shù)和煮制時(shí)間的作用影響程度未達(dá)顯著。通過(guò)綜合分析確定黑順片炮制的最佳工藝為A1B1C3D2，即浸膽7 d、煮10 min、漂片(24 h內(nèi)換3次水)、蒸制2.5 h。

表3 黑順片炮制工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果 n=3

表4 黑順片炮制工藝方差分析結(jié)果

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，再取大小同等級(jí)的新鮮泥附子各3份，每份1000 g，按上述A1B1C3D2最佳工藝進(jìn)行炮制，并對(duì)其炮制過(guò)程分步采樣，檢測(cè)其6種生物堿含量。結(jié)果見(jiàn)圖2。

不同英文字母表示含量存在顯著性差異，P<0.05圖2 黑順片炮制過(guò)程中不同酯型生物堿含量

由圖2可知：3種雙酯型生物堿總含量以生附子(對(duì)照組)為最高，并在炮制過(guò)程中逐步降低；3種單酯型生物堿總含量以黑順片為最高。泥附子浸膽7 d后雙酯型生物堿總含量降低至對(duì)照組的0.91倍，而單酯型生物堿總含量降低至對(duì)照組的0.22倍。煮制過(guò)后，雙酯型生物堿總含量降低至對(duì)照組的0.35倍，而單酯型生物堿總含量降低至對(duì)照組的0.13倍。漂片過(guò)程導(dǎo)致生物堿含量降低，且單酯型生物堿總含量達(dá)整個(gè)黑順片炮制過(guò)程中最低值，降低至對(duì)照組的0.05倍，雙酯型生物堿總含量降低至對(duì)照組的0.26倍。蒸制步驟可使雙酯型生物堿總含量降低至上一步驟的0.15倍，單酯型生物堿總含量增加至上一步驟的21.32倍。按最優(yōu)工藝炮制的黑順片中3種雙酯型生物堿總含量分別降低至對(duì)照組的0.04倍，而3種單酯型生物堿的總含量升高至對(duì)照組的1.23倍。驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)擬合結(jié)果基本一致，黑順片的雙酯型生物堿總含量范圍為0.002 9%～0.014 6%，單酯型生物堿的總含量范圍為0.030 4%～0.039 4%，均符合2020版《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于黑順片的生物堿指標(biāo)限定的要求。

2.4 總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定

對(duì)正交試驗(yàn)及其炮制環(huán)節(jié)中總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果，如表5所示。

表5 炮制樣品的灰分測(cè)定結(jié)果 n=3

從表5可知：生附子中總灰分、酸不溶性灰分最低，膽附子的總灰分最高，說(shuō)明浸膽會(huì)引起鹽分的高殘留，導(dǎo)致其總灰分、酸不溶性灰分值增大，而煮制、漂片工藝可以明顯減少鹽分殘留，從而降低總灰分、酸不溶性灰分。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于附子灰分指標(biāo)的限定為總灰分不超過(guò)6%、酸不溶性灰分不超過(guò)1%，而以本文中優(yōu)化工藝加工的黑順片的總灰分均低于5%，酸不溶性灰分均低于1%，符合最新版藥典要求。

3 討論

現(xiàn)代研究表明附子生品毒性大，所含酯型生物堿既為有效成分，又為毒性成分[13-14]，其中雙酯型生物堿是附子的主要毒性成分，但同時(shí)也具有強(qiáng)心、抗炎鎮(zhèn)痛等作用。雙酯型生物堿理化性質(zhì)不穩(wěn)定，在濕熱的條件下容易發(fā)生水解，一部分轉(zhuǎn)化成單酯型生物堿，另一部分轉(zhuǎn)化成出醇胺型生物堿或者經(jīng)過(guò)酯交換轉(zhuǎn)化成難溶于水的酯型生物堿[15]。炮制是附子減毒增效的重要傳統(tǒng)措施，然而炮制過(guò)度，則令有效成分嚴(yán)重?fù)p失，直接影響藥效。酯型生物堿類成分是藥典規(guī)定的評(píng)價(jià)附子飲片質(zhì)量是否合格的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究以“減毒增效”為目標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了浸膽時(shí)間、煮制時(shí)間、漂片次數(shù)及蒸制時(shí)間4個(gè)工藝參數(shù)對(duì)黑順片炮制效果的影響，采用正交試驗(yàn)及隸屬度法評(píng)價(jià)優(yōu)化了黑順片炮制工藝，最優(yōu)工藝可實(shí)現(xiàn)黑順片的3種單酯型生物堿總含量提高到生附片的1.42～1.83倍，3種雙酯型生物堿總含量降低至生附片的0.01～0.05倍，灰分指標(biāo)亦符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求，表明該工藝不僅降低了附子毒性，同時(shí)又保留了適量毒性成分兼藥效成分的雙酯類生物堿，并有效控制了膽鹽殘留。

目前關(guān)于黑順片傳統(tǒng)炮制工藝爭(zhēng)議最大的問(wèn)題就是膽巴的使用問(wèn)題。浸膽是附子傳統(tǒng)炮制工藝的最初處理工序，具有防腐作用，同時(shí)降低了生物堿含量，然而膽巴對(duì)胃有腐蝕性，若附子飲片膽鹽殘留超標(biāo)不僅會(huì)影響飲片質(zhì)量，還會(huì)引發(fā)附子的不良副作用[16-18]。楊千千等[19]提出使用20%濃度以上的膽巴浸泡泥附子，其質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定；周林等[16]指出泥附子經(jīng)過(guò)浸膽9 d即可達(dá)到防腐的目的，且隨著浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)，單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量會(huì)下降70%以上，這與本試驗(yàn)中關(guān)于浸膽時(shí)間的結(jié)果基本一致。適當(dāng)?shù)目s短浸膽時(shí)間，就可以達(dá)到防腐和減毒的效果。汪云偉[20]提出黑順片“味”的變化與炮制中膽巴的引入有關(guān)，這也是影響黑順片感官評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。劉雨詩(shī)等[21]對(duì)比了有膽附片和無(wú)膽附片的生物堿成分，二者均可降低毒性成分，但有膽炮制存在炮制過(guò)度之嫌，認(rèn)為無(wú)膽炮制工藝不引入無(wú)機(jī)雜質(zhì)，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)隨著技術(shù)發(fā)展，附子炮制出現(xiàn)一些現(xiàn)代炮制方法，如王昌利等[22]將生附片加兩倍量水浸泡24 h至全部泡透后置于鍋內(nèi)蒸10 h，晾干即得。該法總酯型生物堿含量較高，酯型生物堿含量較低，操作較方便，但耗時(shí)較長(zhǎng)。方莉等[23]將生附片經(jīng)過(guò)潤(rùn)濕處理后，0.10 MPa壓力下蒸制150 min，干燥即得。此法工藝簡(jiǎn)便、需要設(shè)備較簡(jiǎn)單、易操作、具有一定的生產(chǎn)指導(dǎo)意義，但該炮制工藝改動(dòng)較大，仍需對(duì)其高溫炮制的作用機(jī)制、毒理學(xué)和藥理學(xué)展開(kāi)研究；楊昌林等[24]進(jìn)行了濕熱蒸制和干熱烘制的探究，其中濕熱蒸制法將生附片加水浸透后，于120 ℃的溫度下蒸制20 min，獲得蒸附片，而干熱烘制法將生附片于150 ℃于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘40 min，即得烘附片。兩種方法均能有效去除毒性成分，并保留有效成分，為附子炮制提供了新路徑。這些新的炮制方法，均印證了蒸制這一環(huán)節(jié)在附子炮制中的關(guān)鍵作用。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》雖然新增了灰分檢測(cè)指標(biāo)，但在具體飲片炮制工藝步驟上仍未進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。藥典收載的黑順片炮制方法由清代流傳至今，經(jīng)受住了時(shí)間的檢驗(yàn)。雖然現(xiàn)代炮制方法多樣，但仍需要經(jīng)過(guò)一系列的藥理、臨床測(cè)試。因此，遵循“守正創(chuàng)新”中醫(yī)藥發(fā)展指導(dǎo)原則在飲片傳統(tǒng)炮制工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化是相對(duì)適用的。