基于LC-MS/MS的酸乳肽譜及ACE抑制活性

于 洋，于文皓，晏嘉澤，董 浩，董家耕，靳 艷,*，祁艷霞

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.遼寧輝山生物科技研究有限公司，遼寧 沈陽 110031）

基于LC-MS/MS的酸乳肽譜及ACE抑制活性

于 洋1,2，于文皓1,2，晏嘉澤2，董 浩2，董家耕3，靳 艷2,*，祁艷霞1,*

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.遼寧輝山生物科技研究有限公司，遼寧 沈陽 110031）

利用液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的方法，對4 種酸乳（優(yōu)味舒風味發(fā)酵乳、風味發(fā)酵乳、初乳24＋K風味發(fā)酵乳和十天風味發(fā)酵乳）的肽譜進行分析，分別鑒定到152、125、364 條和274 條肽段。利用血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制活性比較以上4 種酸乳的生物活性，在相同質量濃度2.0 mg/L時，4 種酸乳ACE抑制率分別為46.84%、42.75%、77.41%和63.84%。初乳24＋K風味發(fā)酵乳含有肽的數(shù)量大、ACE抑制活性高可能與其獨特的原料成分相關。對4 種酸乳的肽譜及ACE抑制活性的考察，為進一步研究酸乳肽的功能特點和ACE抑制活性提供了理論依據(jù)。

酸乳；肽譜；液相色譜-串聯(lián)質譜；ACE抑制活性

酸乳是一種公認的健康食品，是牛乳通過乳酸菌發(fā)酵制成的具特殊風味的乳制品。在酸乳發(fā)酵過程中，有20%左右的蛋白質在乳酸菌的作用下被分解成為小肽和氨基酸等，其中乳酸菌及其分解產物能產生特殊的保健功效，如預防心腦血管疾病、維持改善胃腸道菌群平衡、抗衰老等[1-2]。酸乳中的益生素、VD和鈣對降低2型糖尿病發(fā)病風險有積極影響[3]，大量攝入酸乳及其他乳制品可降低2型糖尿病發(fā)病幾率[4]。因此酸乳是一種很好的提高機體免疫能力、調節(jié)機體生理代謝功能的營養(yǎng)保健食品。

研究表明酸乳中的生物活性肽具有血管緊張素Ⅰ轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性、抗氧化和免疫調節(jié)等活性[5]。ACE是一種在血壓調節(jié)中起關鍵作用的酶[6]，已從牛乳[7]、發(fā)酵乳[8-9]和奶酪[10]中發(fā)現(xiàn)具有降血壓功能的ACE抑制肽。崔磊等[11]使用了凝膠層析分離純化低分子質量肽的方法研究了國內6 種市售酸乳中的ACE抑制活性，6 種酸乳均顯示具有ACE抑制活性。牛乳中的蛋白質在乳酸菌的作用下產生長短、活性各異的肽，目前常規(guī)的分析方法已無法準確反映酸乳中的肽組成及其活性。液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是一種高通量的分析方法，具有靈敏度高、選擇性強、準確性好等特點。隨著色譜和質譜技術的發(fā)展，LC-MS/MS越來越普遍地應用于藥物、食品等多個領域，也被應用于分析鑒定酸乳中的肽[12]。為了解不同酸乳的肽組成與生物活性之間的差異以及這種差異與酸乳原料和菌種之間的相關性，利用LC-MS/MS研究了4 種市售酸乳的肽譜，研究4 種酸乳的ACE抑制活性，并對其肽譜及活性肽進行了分析和比較，以期為酸乳肽譜及活性的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸乳：輝山乳業(yè)出品優(yōu)味舒風味發(fā)酵乳（YWS），風味發(fā)酵乳（FW），初乳24＋K風味發(fā)酵乳（CR24＋K）和十天風味發(fā)酵乳（ST）購自當?shù)爻校?甲酸（formic acid，F(xiàn)A） 美國Fluka公司；乙腈（acetonitrile，ACN，色譜純） 德國Merck公司；甲醇（色譜純） 美國Thermo公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、ACE模擬底物N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl) acryloyl]-L-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG）、兔肺丙酮粉（lung acetone powder from rabbit） 美國Sigma公司；Magic C18AQ反相色譜填料（5 μm，12 nm） 美國MichromBioRecources公司；石英毛細管 美國Polymicro Technologies公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Finnigan Surveyor液相色譜泵、組合型離子阱軌道阱質譜儀（LTQ Orbitrap XL）配有納升電噴霧離子源及Xcalibur2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、SpeedVac真空冷凍干燥機美國Thermo公司；Synergy H1全功能酶標儀 美國BioTek儀器有限公司；Milli-Q超純水一體機 美國Millipore公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取酸乳樣品100 mL，加入50 mL pH 2.0、35 mmol/L NaCl溶液，218×g均質10 min。然后12 235×g、4 ℃條件下離心20 min，收集上清液。由于多肽的分子質量一般在10 kD以下，上清液用10 kD超濾管超濾，12 235×g、室溫條件下離心20 min，收集濾液，用于ACE活性檢測。

1.3.2 樣品的預處理

中國科學院分離分析化學重點實驗室自制的C18SPE預處理柱經3 倍柱體積的乙腈活化，再用3 倍柱體積的0.1%（V/V）TFA溶液洗去乙腈。樣品用50%（V/V）TFA溶液調節(jié)pH值至2～3后過柱。經3 倍柱體積的0.1%（V/V）TFA液脫鹽后，用1 mL 80%（V/V）乙腈/0.1%（V/V）TFA溶液分3 次洗脫，洗脫液冷凍干燥后于－20 ℃保存，用于質譜分析。

1.3.3 反相液相色譜-串聯(lián)質譜分析

將凍干樣品用0.1%（V/V）的甲酸水溶液配制成0.5 μg/μL的溶液，離心，取上清液進行反相液相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）-MS/ MS分析，進樣量為20 μL。色譜分析條件：流動相A為0.1%（V/V）的甲酸溶液，流動相B為0.1%（V/V）的甲酸-乙腈溶液，流速為200 nL/min。梯度洗脫過程如下：0～2 min，0%～5% B；2～95 min，5%～35% B；95～108 min，35%～80% B；108～120 min，80%～0% B。自動進樣系統(tǒng)包括一根4 cm的自制毛細管富集柱（200 μm，內徑）和一根12 cm的自制毛細管分析柱（75 μm，內徑）。兩根柱子均填充C18AQ填料。

質譜分析條件：毛細管的溫度為200 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV，歸一化碰撞能量為35.0%，一級掃描范圍400～2 000 D。均使用數(shù)據(jù)依賴模式對MS和MS/MS進行圖譜采集，掃描模式為全掃描。全掃描中豐度最高的6 個離子峰進行MS/MS掃描，其中動態(tài)排除設置為：重復次數(shù)為2，重復容忍時間為30 s，動態(tài)排除時間為90 s。利用Xcalibur軟件進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。每個樣品重復兩次，對兩次結果中重復的肽段視為有效數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫檢索

Xcalibur采集的*.RAW文件用Thermo Proteome Discoverer Daemon（v1.4）轉換成*.MGF格式，之后用Mascot 2.3.0軟件在牛（bovine，蛋白質數(shù)目為17 890）蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）中進行檢索。搜庫參數(shù)如下：不設置酶切、最大漏切數(shù)和固定修飾，可變修飾設置為甲硫氨酸的氧化（＋15.994 9 D）。母離子的質量容忍偏差為20×10－6，碎片離子為0.8 D。導出肽段時設置Score＞20，P＜0.01，同時控制假陽性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜1%。

1.3.5 ACE抑制活性的檢測

參考Murray等[13]的方法并按本實驗所需條件部分調整方法。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（100 mmol/L，pH 8.3，含300 mmol/L NaCl）配制一定濃度的抑制劑溶液（樣品）和1.6 mmol/L的FAPGG溶液。20 mg兔肺丙酮粉加入20 倍體積的PBS（100 mmol/L，pH 8.3，含5%丙三醇），4 ℃振搖過夜。30 000×g、4 ℃離心30 min，上清液保存于4 ℃，臨用前用PBS（100 mmol/L，pH 8.3，含300 mmol/L NaCl）稀釋5 倍，即為實驗所用的ACE溶液。

實驗設置樣品組和對照組。樣品組：85 μL抑制劑溶液與15 μL的ACE溶液混合均勻，加入100 μL FAPGG溶液，立即于340 nm波長下測定吸光度，記為A0。37 ℃溫育60 min后再次于340 nm波長下測定吸光度，記為A1。測定各個樣品的吸光度，令ΔA＝A0－A1。每個樣品平行測定3 次。對照組：將抑制劑溶液用緩沖溶液替代，其他步驟同樣品組。

計算抑制率的公式如下：

式中：I表示抑制率/%；ΔAcontrol表示對照組0 min與60 min時吸光度的差值；ΔAsample表示樣品組0 min與60 min時吸光度的差值。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 酸乳ACE抑制活性

表 1 4 種酸乳肽樣品ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activities of four yogurt samples

ACE抑制活性是乳源活性肽中比較明確且研究較多的生物活性[14-18]，本研究利用ACE抑制活性作為酸乳活性的檢測指標。表1為4 種酸乳樣品的ACE抑制率，樣品質量濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg/mL。由數(shù)據(jù)可以看出，4 種酸乳樣品的ACE抑制率均具有劑量依賴性，每種酸乳在不同質量濃度之間的ACE抑制率均具有顯著性差異（P＜0.05）；在3 個樣品質量濃度下，相同質量濃度條件下CR24＋K的ACE的抑制率均為最高，且當樣品質量濃度為1.0 mg/mL和2.0 mg/mL時，CR24＋K的ACE的抑制率與其他3 種酸乳相比具有顯著性差異（P＜0.05），因此CR24＋K的ACE抑制能力與其他3 種酸乳相比具有明顯優(yōu)勢。綜上所述，4 種酸乳的ACE抑制能力排序為CR24＋K＞ST＞YWS＞FW。

2.2 基于LC-MS/MS的酸乳肽譜

酸乳按照1.3節(jié)中方法處理后進行LC-MS/MS分析，基峰色譜圖如圖1所示，4 種酸乳的基峰譜圖差異較大，CR24＋K的基峰譜與其他3 種相比，出峰時間較為集中，絕大多數(shù)高豐度的峰出現(xiàn)在20～50 min。所檢測到的肽的維恩（Venn）圖見圖2，YWS、FW、CR24＋K和ST樣品分別鑒定到152、125、364、274 條肽段，其中有23 條肽段在4 種樣品中均檢測到，有52、19、213、79 條肽段分別僅在對應樣品中檢測到。

4 種酸乳樣品中，CR24＋K不僅鑒定到的肽段數(shù)量最多，且獨有肽的數(shù)量同樣最多，364 條肽段中有213 條肽段在其他3 種酸乳中均未鑒定到，其數(shù)量顯著高于其他3 種酸乳的52、19 條和79條。CR24＋K中獨有的213 條肽段中，源于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的肽段分別有48、25、69、71 條。其中一些肽已有文獻報道具有不同生理活性，如源于αs2-酪蛋白的YQKFPQY f（89～95）具有較高的ACE抑制活性[19]；源于β-酪蛋白的PGPIPN f（63～68）具有免疫調節(jié)活性[20]；源于κ-酪蛋白的YYQQKPVA f（42～49）和LPYPY f（56～60）則分別具有抗菌活性[21]和DPP-IV抑制活性[22]。β-酪啡肽是由β-酪蛋白酶解得到的一類阿片活性肽，其中研究最多的β-酪啡肽7（β-casomorphin-7，β-CM7）是來源于β-酪蛋白60～66 位的一種具有阿片活性的七肽物質（YPFPGPI）[23]。β-CM7在牛乳[24]、奶酪[25]等乳制品中均有報道，但在酸乳中沒有檢測出β-CM7[25-26]，本研究的酸乳樣品中也均未檢測到β-CM7。

酸乳商品信息中標注CR24＋K的發(fā)酵菌種為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，與YWS、FW所用菌種相同，盡管相同菌株投放比例不同也可能會影響肽的產量，但并非導致肽的數(shù)量及活性差異的主要原因。4 種酸乳的蛋白質量濃度不同，但質譜分析時所用樣品蛋白質量濃度相同，因此肽的數(shù)量及活性差異也不是由蛋白質量濃度所引起。這些表明，酸乳原料組成和配方與肽的數(shù)量及抑制活性可能有直接關系，酸乳肽譜及活性的研究可為酸乳產品的開發(fā)設計提供技術支持。

圖 1 4 種酸乳基峰色譜圖Fig. 1 Base peak chromatograms of four yogurt samples by LC-MS/MS analysis

圖 2 LC-MS/MS鑒定4 種酸乳肽數(shù)目Fig. 2 Venn diagram showing the numbers of peptides identif i ed in four yogurts by LC-MS/MS analysis

2.3 酸乳中ACE抑制肽

4 種酸乳中鑒定到已有文獻報道的典型的ACE抑制肽，如從YWS中鑒定到的源于αs2-酪蛋白的AMKPWIQPK f（189～197），從CR24＋K和ST中鑒定到的源于β-酪蛋白的LNVPGEIVE f（6～14）、NIPPLTQTPV f（73～82）等肽段均具有較高的ACE抑制活性，半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）分別為600、300、173?μmol/L[27]。由2.1、2.2節(jié)可知CR24＋K ACE抑制活性最高且鑒定到的肽段數(shù)最多。表2列出了CR24＋K獨有肽段中的ACE抑制肽與潛在的ACE抑制肽。其中4 條肽段與文獻中的肽段序列一致，分別為源于αs1-酪蛋白FPEVFGK f（28～35），源于β-酪蛋白的TPVVVPPFLQP f（80～90）、KVLPVPQ f（169～175）以及源于κ-酪蛋白的LPYPY f（56～60），IC50分別為140、749、1 000、28.9 μmol/L。6 條肽段與文獻中的肽段序列相似且C末端三肽的序列完全一致。由于ACE抑制肽的C末端三肽與其抑制能力關系緊密[28]，因此可以認為這6 條肽段具有潛在的ACE抑制活性。在檢測到的ACE抑制肽或潛在的ACE抑制肽中，源于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白的ACE抑制肽分別有2、1、1 條，源于β-酪蛋白的有6 條，可見由β-酪蛋白釋放的ACE抑制肽數(shù)量較多。

表 2 CR24＋K 213 條獨有肽段中的ACE抑制肽或潛在的ACE抑制肽Table 2 ACE inhibitory peptides and potential ACE inhibitory peptides out of 213 unique peptides of Churu24+K fl avor fermented milk

3 結 論

本研究利用LC-MS/MS對4 種市售酸乳的肽譜進行研究，YWS、FW、CR24＋K和ST共分別鑒定到152、125、364、274 條肽段，其中獨有的肽段分別有52、19、213、79 條。初乳24＋K風味發(fā)酵乳擁有最多的總肽段數(shù)和獨有的肽段數(shù)。以ACE抑制活性作為酸乳生物活性檢測指標，結果顯示初乳24＋K風味發(fā)酵乳的ACE的抑制活性最高。經過肽譜、ACE抑制活性與原料、菌種的相關性研究，表明酸乳的原料和組成可能影響其產品的肽數(shù)量和ACE抑制活性。

通過對酸乳肽譜和ACE抑制活性的考察，可更好地了解酸乳肽譜及活性的性質和特點，為進一步研究酸乳肽的功能和特點以及乳源ACE抑制肽提供了理論依據(jù)。

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Peptide Prof i ling of Yogurts Identif i ed by LC-MS/MS and Their ACE Inhibitory Activities

YU Yang1,2, YU Wenhao1,2, YAN Jiaze2, DONG Hao2, DONG Jiageng3, JIN Yan2,*, QI Yanxia1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical and Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China; 3. Liaoning Huishan Biotechnology Research Co. Ltd., Shenyang 110031, China)

This study investigated the peptide prof i ling of four yogurt samples (Youweishu fl avored fermented milk, plain fl avored fermented milk, Churu 24+K fl avored fermented milk and Shitian fl avored fermented milk) from local market by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A total of 152, 125, 364 and 274 peptides were identif i ed from the yogurts by LC-MS/MS, respectively. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity was used to evaluate the biological activities of yogurt peptides. The ACE inhibition rates of peptides from these yogurts were 46.84%, 42.75%, 77.41% and 63.84% at a concentration of 2.0 mg/L, respectively. The large number of identif i ed peptides and high ACE inhibitory activities in Churu 24+K fl avor fermented milk may be related to its special ingredients. This study may provide the theoretical basis for further study on the functions and ACE inhibitory activity of yogurt peptides.

yogurt; peptide prof i ling; LC-MS/MS; ACE inhibitory activity

10.7506/spkx1002-6630-201705034

TS252.54

A

1002-6630（2017）05-0208-05

于洋, 于文皓, 晏嘉澤, 等. 基于LC-MS/MS的酸乳肽譜及ACE抑制活性[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 208-212.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705034. http://www.spkx.net.cn

YU Yang, YU Wenhao, YAN Jiaze, et al. Peptide prof i ling of yogurts identif i ed by LC-MS/MS and their ACE inhibitory activities[J]. Food Science, 2017, 38(5): 208-212. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705034. http://www.spkx.net.cn

2016-05-18

遼寧省博士啟動基金項目（20141107）

于洋（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：yy361878997@163.com

*通信作者：靳艷（1968—），女，研究員，博士，研究方向為生物化工。E-mail：yanjin@dicp.ac.cn

祁艷霞（1982—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：qiyanxia@dlou.edu.cn