鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮

李秀秀，曾維偉，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮

李秀秀，曾維偉，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-amplif i cation and denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）技術(shù)，分析4 ℃冷藏條件下鯽魚肌肉和魚鰓的菌相組成及變化，并利用不同濃度（效價(jià)分別為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL）抗菌脂肽溶液對(duì)鯽魚進(jìn)行浸泡處理，以未處理作為對(duì)照，分別測(cè)定其菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、pH值和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）等指標(biāo)，評(píng)價(jià)抗菌脂肽對(duì)鯽魚冷藏保鮮效果。結(jié)果表明：鯽魚貯藏過程中的微生物具有多樣性，PCRDGGE技術(shù)確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）和熱殺索絲菌屬（Brochothrix thermosphacta）為鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。而棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）和氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）為鯽魚魚鰓的主要腐敗菌群，表明魚肉和魚鰓在貯藏過程中，導(dǎo)致腐敗的主要腐敗菌群有一定差異性。同時(shí)，不同濃度的抗菌脂肽對(duì)鯽魚均有明顯的防腐保鮮作用，有效抑制了鯽魚菌落總數(shù)、TVB-N值和TBA值的增加以及pH值的升高。其中，高濃度抗菌脂肽（效價(jià)為67 608 IU/mL）在4 ℃貯藏條件下使鯽魚的貨架期延長(zhǎng)了6 d，說明抗菌脂肽對(duì)鯽魚具有良好的保鮮作用，能明顯延緩鯽魚的腐敗變質(zhì)。

鯽魚；腐敗微生物；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)；抗菌脂肽；保鮮

鯽魚是我國(guó)傳統(tǒng)的淡水魚類，其產(chǎn)量居于各淡水魚前列。因鯽魚中營(yíng)養(yǎng)豐富，含有鈣、鐵、維生素、核黃素等許多營(yíng)養(yǎng)成分，而深受大眾消費(fèi)者的喜愛[1]，但魚肉中蛋白質(zhì)和水分含量高，且含有多種不飽和脂肪酸及內(nèi)源酶，使得鯽魚容易腐敗[2]。水產(chǎn)品的腐敗主要受來自自身和環(huán)境中的微生物，以及本身的酶和脂肪氧化等因素的影響，其中微生物是造成腐敗的主要因素。因此，研究魚類腐敗菌的生長(zhǎng)，探究細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化并采取相應(yīng)的能夠有效抑制微生物生長(zhǎng)的保鮮方法，對(duì)水產(chǎn)品捕撈、加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售過程中提高水產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期至關(guān)重要[3]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-amplif i cation and denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）是研究微生物群落組成及親緣關(guān)系的分子指紋技術(shù)，可以高效、直接、快速全面地分析微生物組成及群落結(jié)構(gòu)[4-5]。國(guó)內(nèi)外已有很多研究將該方法有效地用來分析食品中腐敗菌[6-11]。目前DGGE技術(shù)在水產(chǎn)品腐敗菌群結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用研究較多，但在鯽魚貯藏過程中的腐敗菌分析國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。有關(guān)鯽魚貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化情況，各類微生物的生長(zhǎng)、腐敗特點(diǎn)，如何利用保鮮技術(shù)高效、針對(duì)性抑制鯽魚中的微生物生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期等，需有待進(jìn)一步研究。

目前，水產(chǎn)品保鮮技術(shù)主要有冷凍保鮮、氣調(diào)保鮮、化學(xué)保鮮及輻照保鮮等，但以上技術(shù)存在蛋白質(zhì)變性、營(yíng)養(yǎng)成分流失和化學(xué)藥品殘留等問題[12]，因而安全、無(wú)毒的生物保鮮技術(shù)受到了人們廣泛關(guān)注?？咕模╨ipopeptide）是指一類由芽孢桿菌（Bacillus sp.）通過非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成的具有高效抑菌活性的脂肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)含有7～10 個(gè)氨基酸和1 個(gè)短鏈脂肪酸（C9～C13）組成的環(huán)型脂肽，具有抗菌性強(qiáng)、抗菌譜廣、安全無(wú)毒、穩(wěn)定性好等特性，因而抗菌脂肽作為一種新型、高效、廣譜的生物源天然食品防腐劑，在食品加工中具有潛在的應(yīng)用前景[13-14]。目前抗菌脂肽已在食品保鮮中廣泛應(yīng)用，如肉制品[15]、焙烤制品[16]、果蔬采后保鮮[17]等。但在淡水魚產(chǎn)品保鮮方面的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用PCR-DGGE技術(shù)，研究鯽魚腐敗過程中的菌相變化，確定其在貯藏過程中的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌，探討抗菌脂肽對(duì)鯽魚防腐保鮮作用，旨在為抗菌脂肽在水產(chǎn)保鮮中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鯽魚（300～400 g）購(gòu)于南京市玄武區(qū)鐵匠營(yíng)蘇果超市，產(chǎn)地為江蘇省興化市。

菌種Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4，為本實(shí)驗(yàn)室保藏。營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH 7.0；平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

MgO、硼酸、鹽酸（均為分析純）、甲基紅、亞甲基藍(lán) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5084R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；高壓蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；PCR擴(kuò)增儀美國(guó)艾爾特公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Dcode DGGE電泳系統(tǒng)（配有凝膠成像系統(tǒng)）美國(guó)伯樂公司；拍擊式均質(zhì)機(jī) 法國(guó)Interscience公司；3-Star型pH計(jì) 美國(guó)Orion公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

將從超市買的鮮活鯽魚在最短的時(shí)間內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，迅速敲頭致死，在無(wú)菌條件下用無(wú)菌剪刀分別取25 g魚肉樣品（含魚鱗，魚皮）置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，并加入225 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水中；取10 g魚鰓置于無(wú)菌均質(zhì)袋中加入90 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水中，放入均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min。具體操作參照GB 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮和pH值的測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉質(zhì)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中半微量定氮法進(jìn)行測(cè)定。

取10 g樣品加入100 mL的煮沸冷卻后的蒸餾水浸提30 min，過濾后濾液使用經(jīng)校正劑校正后的3-Star型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 提取DNA的樣品處理

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌剪刀分別剪取魚肉25 g置于裝有50 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，魚鰓10 g置于裝有25 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)2 min。200 目絹布過濾后，加入25 mL生理鹽水，濾液1 000 r/min離心10 min，去沉淀，濾液10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀加入5 mL無(wú)菌雙蒸水，10 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀懸浮于1 mL TE buffer 中置于－20 ℃條件下備用。

1.3.4 總DNA的提取

按照Omega公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法操作，提取細(xì)菌總DNA，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。

1.3.5 PCR擴(kuò)增

參考陳慧斌等[18]的方法采用巢式PCR擴(kuò)增鯽魚魚肉和鯽魚魚鰓中細(xì)菌菌群的16SrDNA V3區(qū)。第1輪擴(kuò)增16 S rDNA，引物為27F和1492R；第2輪擴(kuò)增V3區(qū)，正向引物為5’端帶40GC夾子的338F（5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG CAC-3’），反向引物為518R（5’-ATT ACC GCA GCT GCT GG-3’）。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。第2輪對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V3區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第2輪V3區(qū)擴(kuò)增以第1輪16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100 倍后的產(chǎn)物為模版。兩輪均用無(wú)菌ddH2O代替模版作為陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：0.25 μL的Taq DNA聚合酶，10×buffer （Mg2＋Plus） 5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，模板4 μL，補(bǔ)ddH2O為34.75 μL。擴(kuò)增條件擴(kuò)增條件為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，循環(huán)30 次；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.3.6 細(xì)菌DGGE分析

鯽魚魚肉和魚鰓中菌群的DGGE分析參照Chen Huibin等[19]的方法并加以改進(jìn)。具體方法如下：采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為38%～55%（100%的變性劑：尿素42 g＋甲酰胺 40 mL/100 mL）。實(shí)驗(yàn)在Biorad Dcode DGGE電泳儀上進(jìn)行，上樣量為15 μL，在電泳系統(tǒng)電壓65 V，溫度60 ℃條件下電泳時(shí)間13.5 h。電泳結(jié)束后將膠片在SYBR GreenⅠ中染色30 min后取出，在然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照，采用Quantity One軟件分析圖像。

1.3.7 條帶回收及測(cè)序

在紫外燈下對(duì)各泳道的主要片段進(jìn)行切割，回收24 條條帶，放入1.5 mL離心管中，加入40 μL無(wú)菌ddH2O，搗碎，置于4 ℃條件下過夜溶解。取上述回收DNA溶液2 μL作為模版，以338F（無(wú)GC夾子）和518R作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物，瓊脂糖電泳檢查產(chǎn)量及特異性。剩余PCR產(chǎn)物，采用PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化。經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將陽(yáng)性克隆株由上海生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序后獲得的24 個(gè)主要細(xì)菌16S rDNA基因片段序列，登錄NCBI（www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/）查詢測(cè)序結(jié)果。

1.3.8 抗菌脂肽在鯽魚中保鮮應(yīng)用

1.3.8.1 抗菌脂肽的制備

Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4產(chǎn)抗菌脂肽粗提物為芬薺素（fengycins）、表面活性素（surfactins）和伊枯草菌素（iturins）的混合物[13]。抗菌脂肽制備方法參考文獻(xiàn)[20]并作修改：將本實(shí)驗(yàn)室保藏的Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4接種于試管斜面PAD瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化菌種，再將活化后的菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基BPY培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液。種子液以4%濃度接種于Landy發(fā)酵培養(yǎng)基中，在33 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵36 h后取出，9 000 r/min離心15 min除去菌體，用HCl將上清液調(diào)節(jié)pH值至2，然后輕微攪動(dòng)或靜止于4 ℃條件下12 h，最后9 000 r/min離心10 min收集沉淀，加入60%的乙醇抽提（約每50 mL的發(fā)酵液，加入1 mL的60%的乙醇），再用NaOH中和，10 000 r/min離心10 min取上清液，獲得抗菌粗提物的濃縮儲(chǔ)備液。并以Nisin做標(biāo)準(zhǔn)物，用效價(jià)的方法定量其抑菌特性。

1.3.8.2 抗菌脂肽對(duì)鯽魚中腐敗菌的最小抑菌濃度抑菌實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌條件下將抗菌脂肽倍比稀釋液按稀釋度從高到低加入無(wú)菌96 孔板的第1～11列，每孔加100 μL，第12孔為陽(yáng)性對(duì)照加入等量的無(wú)菌水。隨后每孔加入100 μL濃度為105～106CFU/mL的熒光假單胞菌、氣單胞菌、熱殺索絲菌和不動(dòng)桿菌菌液，密封混勻。用酶標(biāo)儀測(cè)試0 h的OD630nm值，然后將96 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)試24 h的OD630nm值。對(duì)比0 h的OD630nm值和24 h的OD630nm值，從而得出該抗菌脂肽的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.8.3 不同濃度抗菌脂肽對(duì)鯽魚的保鮮效果

將一定量的抗菌脂肽ES-2-4溶解在無(wú)菌水溶液中，稀釋制得效價(jià)為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽保鮮液。將新鮮鯽魚敲頭致死，去鱗，去頭，去內(nèi)臟，用無(wú)菌水沖洗干凈后晾干，分為處理組和對(duì)照組6 個(gè)組。分別在相應(yīng)效價(jià)為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽保鮮液浸泡30 min，取出瀝干水分，放入到無(wú)菌自封袋中置于冰箱中貯藏，控制貯藏溫度（4±1） ℃，每隔2 d取樣進(jìn)行菌落總數(shù)、TVB-N值、pH值和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）指標(biāo)的測(cè)定，TBA測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]方法，結(jié)果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）計(jì)，單位表示為：mg MDA/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚貯藏期間的菌落總數(shù)及各指標(biāo)的變化

表 1 鯽魚在4 ℃貯藏條件下微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)的變化Table 1 Changes in microbial and physicochemical properties of crucian carp during storage at 4 ℃

由表1可以看出，鯽魚貯藏期間魚鰓中初始菌相菌落總數(shù)為（5.85±0.11）（lg（CFU/g）），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于魚肉中的菌落總數(shù)（3.81±0.06）（lg（CFU/g））。魚肉在第6天菌落總數(shù)為（6.38±0.15）（lg（CFU/g）），已經(jīng)超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌落總數(shù)6（lg（CFU/g）），而魚鰓中的菌落總數(shù)在第2天就已經(jīng)達(dá)到（6.86±0.07）（lg（CFU/g））；鯽魚的初始pH值為6.23±0.03，由于糖酵解的作用產(chǎn)生乳酸有一個(gè)下降的過程，之后由于蛋白質(zhì)的分解pH值又有一個(gè)上升的過程，腐敗終點(diǎn)pH值達(dá)到6.40±0.12，而腐敗后期達(dá)到7.27±0.09；TVB-N是多肽和氨基酸在微生物作用下的分解產(chǎn)物，通常可以作為魚類初期腐敗的指標(biāo)。鯽魚的TVB-N的初始值為（9.42±0.69） mg N/100 g，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N值不斷增加，當(dāng)腐敗終點(diǎn)時(shí)TVB-N值達(dá)到（18.87±1.30） mg N/100 g，腐敗后期達(dá)到（21.37±0.11） mg N/100 g。

2.2 鯽魚貯藏過程中優(yōu)勢(shì)菌的分析

圖 1 鯽魚在4 ℃條件下貯藏細(xì)菌的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE fi ngerprinting of PCR products of DNA extracted from crucian carp stored at 4 ℃

DGGE分析結(jié)果如圖1所示。DGGE圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類，條帶亮度大小代表微生物數(shù)量的多少，越亮則代表微生物數(shù)量越多[21]。由圖1可以看出，魚肉和魚鰓在貯藏過程中條帶存在一定的差異。將不同條帶割膠回收收后的測(cè)序結(jié)果見表2。

表 2 DGGE目標(biāo)條帶基因片段序列的比對(duì)分析Table 2 Sequence analysis of selected bands in DGGE

由圖1可知，鯽魚魚肉初始菌相條帶較多且沒有較亮的條帶，說明微生物具有較高的多樣性。貯藏2 d時(shí)，微生物菌群發(fā)生變化，條帶3、4、5變亮，分別屬于棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）和漫球菌屬（Vagococcus sp.）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏6 d即腐敗終點(diǎn)時(shí)條帶3、4、5消失，可能是其他菌的代謝產(chǎn)物及環(huán)境的不適應(yīng)抑制了這些菌的生長(zhǎng)。但腐敗后期第8天條帶3、4、5又出現(xiàn)較暗的條帶，可能是腐敗終點(diǎn)未被完全抑制住，腐敗后期又重新獲得生長(zhǎng)，使菌群比例發(fā)生改變的結(jié)果。條帶6、11、13、15、18、22均是在貯藏中期和腐敗終點(diǎn)時(shí)出現(xiàn)，分別屬于熱殺索絲菌屬（Brochothrix thermosphacta）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.），且條帶18、6、10、11條帶明顯的亮于其他條帶，尤其條帶18為最亮條帶，表明它的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)地位，這與Gram等[22]關(guān)于特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）理論相符：特定腐敗菌在產(chǎn)品貯藏初期數(shù)量很少，僅占微生物群落的很少部分，但在產(chǎn)品腐敗過程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。而條帶10氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）從貯藏初期至腐敗后期都存在，說明它也是鯽魚腐敗時(shí)的主要腐敗菌之一。因此，確定假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬為4 ℃貯藏鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

魚鰓DGGE圖譜與魚肉DGGE圖譜并不完全相同。魚鰓貯藏初始時(shí)就有5、12、16條亮的條帶，分別屬于漫球菌屬 （Vagococcus sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter pulmonis）。貯藏2 d條帶6、10、11、14、18變成亮帶，條帶5、12、16均消失，說明微生物菌群發(fā)生變化，漫游球菌屬和大腸桿菌屬和嗜冷桿菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)逐漸受到抑制。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏中期、腐敗終點(diǎn)和腐敗后期時(shí)即貯藏4、6 d和8 d時(shí)，條帶3、4、8、10、24處于較亮的狀態(tài)，分別代表棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、氣單胞菌屬、假單胞菌屬，其中3、4、10為最亮條帶，確定棉子糖乳球菌、從毛單胞菌屬、氣單胞菌屬為4℃貯藏魚鰓的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。腐敗后期條帶14、18又出現(xiàn)，可能是腐敗后期那些沒完全被抑制住的菌種又重新獲得生長(zhǎng)空間，使菌群的比例發(fā)生了改變而導(dǎo)致，說明假單胞菌屬亦是魚鰓腐敗菌的一部分，但在數(shù)量上不占主導(dǎo)。

表 3 鯽魚魚肉和魚鰓4 ℃貯藏過程中細(xì)菌多樣性的相似性Table 3 Similarity of bacterial diversity between fl esh and grill of crucian carp

根據(jù)DGGE圖譜中每個(gè)樣品不同條帶的強(qiáng)度及遷移率，對(duì)每個(gè)樣品的條帶圖譜進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析。由表3可知，鯽魚魚肉和魚鰓在不同貯藏時(shí)期相似性不大。鯽魚魚肉在貯藏中期即第4天和腐敗終點(diǎn)即第6天相似性最高，為61.1%；而鯽魚魚鰓在腐敗終點(diǎn)第6天與腐敗后期第8天相似性最高77.7%。鯽魚魚肉和魚鰓在初始和腐敗終點(diǎn)時(shí)的相似性均不高分別為13.1%和21.2%，這可能是因?yàn)轸~鰓與外界環(huán)境接觸比較多，反映的主要是水環(huán)境中的微生物群落。

2.3 抗菌脂肽對(duì)鯽魚腐敗菌的抑菌效果

結(jié)合DGGE技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有選擇性地分離出鯽魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌熒光假單胞菌、熱殺索絲菌、氣單胞菌和不動(dòng)桿菌，并用于抗菌脂肽MIC測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

表 4 抗菌脂肽對(duì)鯽魚腐敗菌的MICTable 4 MIC of antimicrobial lipopeptide for inhibition of spoilage bacteria in crucian carp

由表4可見，抗菌脂肽對(duì)鯽魚中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌均有抑制作用，其中對(duì)熱殺索絲菌的MIC最小為115 IU/mL，對(duì)熒光假單胞菌、不動(dòng)桿菌和氣單胞菌的MIC均為1 175 IU/mL。

2.4 抗菌脂肽的防腐保鮮效果

表 5 4 ℃貯藏條件下不同處理鯽魚中微生物數(shù)量變化Table 5 Changes in microbial counts of crucian carp during storage at 4 ℃

從表5可知，效價(jià)為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽對(duì)鯽魚均有很好的保鮮效果，且隨著效價(jià)的增大，其抑菌效果是逐漸增加的。未加抗菌脂肽對(duì)照組鯽魚在第2天菌落總數(shù)達(dá)到6.72 （lg（CFU/g）），已超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌落總數(shù)6 （lg（CFU/g）），而添加了抗菌脂肽的處理組在第2天菌落總數(shù)均未超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌落總數(shù)6 （lg（CFU/g））。在第4天除效價(jià)為67 608 IU/mL和32 359 IU/mL的處理組外，其他組均超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌落總數(shù)6 （lg（CFU/g））。而效價(jià)為67 608 IU/mL的處理組在第8天菌落總數(shù)才超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌落總數(shù)6 （lg（CFU/g））。

圖 2 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚TVB-N值的變化Fig. 2 Changes in TVB-N of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖2可知，抗菌脂肽對(duì)鯽魚T V B-N值的增長(zhǎng)有很好的抑制作用。對(duì)照組初始值為（10.04±0.71） mg N/100 g，而其他處理組初始值均在7 mg N/100 g左右。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的TVB-N的值始終高于處理組。貯藏8 d后，對(duì)照組TVB-N值最高達(dá)到（26.25±0.82） mg N/100 g，而效價(jià)為67 608 IU/mL和32 359 IU/mL的抗菌脂肽處理組的TVB-N值增長(zhǎng)的最緩慢，僅為（17.04±0.35）、（18.97±0.52） mg N/100 g。但各處理組TVB-N值在腐敗終點(diǎn)時(shí)始終未超過25 mg N/100 g。

圖 3 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚pH值的變化Fig. 3 Changes in pH of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖3可知，無(wú)論是對(duì)照組還是抗菌脂肽處理組鯽魚pH值均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，對(duì)照組與處理組初始值幾乎無(wú)差異均在6.3左右；4 ℃條件下貯藏2 d后，各組pH值迅速下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)pH值開始上升，但最終pH值都未超過7。其中無(wú)論是對(duì)照組還是處理組均是在第4天迅速上升，之后便緩慢上升。腐敗終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組和處理組的pH值均在在6.3～6.5左右，但各處理組pH值始終低于對(duì)照組pH值。

圖 4 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚TBA值的變化Fig. 4 Changes in TBA value of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖4可知，抗菌脂肽各處理組均能有效地降低鯽魚的TBA值。各組初始TBA值差異不大，均在0.1～0.2 mg MDA/kg左右，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組TBA值增長(zhǎng)速度顯著大于各保鮮組。貯藏8 d后，對(duì)照組鯽魚TBA值為（1.718±0.034） mg MDA/kg。而效價(jià)為1 157 IU/mL抗菌脂肽處理組的TBA值為（1.597±0.044） mg MDA/kg，與對(duì)照組相差不大，效價(jià)為67 608 IU/mL的抗菌脂肽處理組TBA值為（0.839±0.016） mg MDA/kg，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討 論

應(yīng)用PCR-DGGE分析水產(chǎn)品在貯藏過程中微生物的組成及變化有許多報(bào)道。王建輝等[23]通過PCR-DGGE技術(shù)研究冷藏過程中草魚肌肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和熱殺索絲菌屬是其冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。許振偉等[24]也發(fā)現(xiàn)有氧冷藏鯉魚腐敗終點(diǎn)的腐敗菌為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，藍(lán)蔚青等[25]也采用PCRDGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和希瓦氏菌屬為冷藏帶魚貯藏后期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。由此可見，大多數(shù)水產(chǎn)品中，假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬和希瓦氏菌屬等腐敗菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

本研究運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析冷藏鯽魚貯藏期間的菌相組成及變化，微生物菌群結(jié)構(gòu)隨鯽魚貯藏時(shí)間而變化，貯藏2 d 鯽魚各部位的細(xì)菌種類呈現(xiàn)多樣性；貯藏4、6 d后魚體各部位的細(xì)菌的種類明顯減少，而優(yōu)勢(shì)菌群明顯。通過DGGE圖譜中對(duì)主要條帶的測(cè)序和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，確定假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌屬為鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。而棉子糖乳球菌屬、從毛單胞菌屬、氣單胞菌屬為鯽魚魚鰓的主要腐敗菌群，表明魚肉和魚鰓在貯藏過程中，導(dǎo)致腐敗的主要腐敗菌群有一定差異性。高祥英[26]采用傳統(tǒng)方法分離鯽魚中的腐敗菌發(fā)現(xiàn)腐敗終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌屬和假單胞菌屬，本研究在后期也檢測(cè)到了希瓦氏菌屬，但是條帶相對(duì)于假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞屬的條帶較暗。這可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)的淡水魚細(xì)菌含量及種類存在差異，其菌相受到影響所致。研究結(jié)果說明PCR-DGGE技術(shù)能有效地應(yīng)用于冷藏鯽魚中微生物的研究，直觀地反映冷藏鯽魚貯藏期間主要微生物群落及其菌相的動(dòng)態(tài)變化過程。

同時(shí)，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)與16S rDNA基因鑒定技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)冷藏鯽魚在貯藏不同階段的微生物進(jìn)行分離、純化和鑒定，確定冷藏鯽魚的主要腐敗菌群為假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌屬。因此，可以通過靶向抑制這些特定腐敗菌的生長(zhǎng)來控制鯽魚腐敗變質(zhì)。首先，通過抗菌脂肽對(duì)鯽魚防腐保鮮效果研究中，發(fā)現(xiàn)抗菌脂肽對(duì)鯽魚中的腐敗菌熒光假單胞菌、熱殺索絲菌、不動(dòng)桿菌、氣單胞菌的最小抑菌濃度分別為1 175、115、1 175、1 175 IU/mL。其次，不同濃度的抗菌脂肽對(duì)鯽魚均有明顯的防腐保鮮作用，有效抑制了鯽魚菌落總數(shù)、TVB-N值的增長(zhǎng)、pH值的升高以及TBA值的增長(zhǎng)。其中，效價(jià)為67 608 IU/mL的抗菌脂肽在4 ℃貯藏條件下，使鯽魚的貨架期延長(zhǎng)了6 d，說明抗菌脂肽對(duì)鯽魚具有良好的保鮮作用，明顯延緩鯽魚的腐敗變質(zhì)。而目前乳酸鏈球菌素Nisin作為一種高效、無(wú)毒、安全和營(yíng)養(yǎng)的生物保鮮劑，已被許多國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮中[27-28]。Nisin能夠有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，但對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果并不好，且在中性和堿性條件下對(duì)熱不穩(wěn)定。從已有的報(bào)道來看，Nisin主要用來抑制水產(chǎn)品中單增李斯特菌的生長(zhǎng)，一般與其他保鮮劑復(fù)合使用來增強(qiáng)抑菌作用[29-30]。與化學(xué)防腐劑和生物防腐劑Nisin相比，特別是一些發(fā)達(dá)國(guó)家在某些食品中禁止使用苯甲酸鈉等化學(xué)防腐劑的現(xiàn)狀而言，抗菌脂肽能有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)，特別是其本身為氨基酸組成的肽鏈，安全性高，王東[31]發(fā)現(xiàn)納豆抗菌脂肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有良好的保鮮作用，不僅可以明顯抑制細(xì)菌的增長(zhǎng)還能降低TVB-N值和pH值的增加，與本研究結(jié)果類似。因而抗菌脂肽作為新型綠色生物防腐劑在水產(chǎn)品保鮮中具有潛在的應(yīng)用前景。

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PCR-DGGE Analysis of Microbial Community Composition and Preservation of Crucian Carp during Storage

LI Xiuxiu, ZENG Weiwei, LU Zhaoxin, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, Lü Fengxia*
(College of Food and Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The microbial community structure of crucian carp was studied by polymerase chain reaction-amplification and denaturing gradient gel electrophorsis (PCR-DGGE) during storage at 4 ℃. Meanwhile, in order to use it for the preservation of crucian carp, the antimicrobial effect of antimicrobial lipopeptide was evaluated through the determination of total bacterial counts, total volatile basic nitrogen (TVB-N), pH and thiobarbituric acid (TBA). The results showed that the microbial community of crucian carp was diverse during storage. Specif i cally, Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. and Brochothrix thermosphacta were the main spoilage microorganisms, and Pseudomonas fluorescens was the dominant spoilage microorganism in the flesh of the fish, while Lactococcus raffinolactis, Comamonas sp. and Aeromonas sp. were the main spoilage microorganisms in the gill. These results also indicated that although the microbial community compositions in the flesh and gill of crucian carp were different, but they showed a similar trend during storage. On the other hand, the antimicrobial lipopeptide at different concentrations signif i cantly inhibited the increase of total bacterial counts, TVB-N, pH and TBA. The lipopeptide at a concentration of 67 608 IU/mL extended the shelf-life of crucian carp by up to 6 days during storage at 4 ℃. All these fi ndings demonstrated that the antimicrobial lipopeptide can signif i cantly inhibit the growth of spoilage microorganisms in crucian carp, thus being a promising preservative.

crucian carp; spoilage bacteria; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); antimicrobial lipopeptide; preservation

10.7506/spkx1002-6630-201705045

TS254.4

A

1002-6630（2017）05-0274-07

李秀秀, 曾維偉, 陸兆新, 等. 鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 274-280. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705045. http://www.spkx.net.cn

LI Xiuxiu, ZENG Weiwei, LU Zhaoxin, et al. PCR-DGGE analysis of microbial community composition and preservation of crucian carp during storage[J]. Food Science, 2017, 38(5): 274-280. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705045. http://www.spkx.net.cn

2016-08-12

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B04）

李秀秀（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：2014108044@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn