內質網分子伴侶ＧＲＰ９４在瘢痕疙瘩中的表達

[摘要]目的：觀察內質網分子伴侶GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中的表達，探討GRP94在瘢痕疙瘩發(fā)生中的作用。方法：用免疫組織化學法和免疫印跡法分別檢測12例瘢痕疙瘩與12例正常皮膚組織中GRP94的表達。結果：①GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織的角質形成細胞、成纖維細胞、炎癥細胞、血管內皮細胞以及毛囊、汗腺、皮脂腺等細胞質及少數(shù)細胞的核中表達。②表皮中GRP94的表達量在兩種組織無顯著性差異（P>0.05）；真皮中GRP94陽性成纖維細胞數(shù)在瘢痕疙瘩組明顯高于（1283.33±565.10/mm2）正常皮膚組（238.33±255.62/mm2），（P<0.05）。免疫印跡法實驗結果進一步證實了GRP94的含量在瘢痕疙瘩組（0.50±0.07）高于正常皮膚組（0.15±0.03），（P<0.05）。結論：GRP94在瘢痕疙瘩成纖維細胞中高表達，提示內質網應激與瘢痕疙瘩的過度增殖有關。

[關鍵詞]內質網；GRP94；瘢痕疙瘩

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）09-1184-02

Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 in Keloid

NIE Fang-fei，CHEN Dong-ming，ZHAO Xia，SUN Dong-jie

（Department of Plastic Surgery， the Third Hospital of Pecking University， Beijing 100083，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between GRP94 and keloid by detecting the expression of GRP94 protein in keloid and normal skin tissue.MethodsImmunohistochemistry staining and western blotting were used in 12 cases of keloid and 12 cases of normal skin tissue. Results①GRP94 mainly expressed in cytoplasm，partially anchored in nucleus of keratinocytes，fibroblasts，inflamatary cells and endothelial cells.Hair follicles，sweat glands and sebaceous glands were also stained positively. ②Although the expression level of GRP94 between the two groups in epidermis was no significant difference（P>0.05）. The positively stained fibroblast cell number in dermis was found significantly increased in keloid group(1283.33±565.10/mm2）， compared with normal skin group(238.33±255.62/mm2)（P<0.05）.This result was verified by the statistical data from western blotting test.The protein expression level of GRP94 was (0.50±0.07)in keloid and(0.15±0.03)in normal skin tissue(P<0.05).ConclusionThe overexpression of GRP94 in fibroblast of keloid supports a possible role of endoplasmic reticulum stress in the excessive hyperplasia of keloid.

Key words: endoplasmic reticulum;GRP94;keloid

瘢痕疙瘩是瘢痕形成機制的代表性病變[1]，是以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的皮膚膠原性疾病，表現(xiàn)為過度生長，超出原損傷范圍，侵犯鄰近組織，呈瘤樣增生，是整形外科面臨的難題之一。葡萄糖調節(jié)蛋白94（glucose-related protein 94，GRP94）屬于內質網分子伴侶，參與內質網應激反應。GRP94與腫瘤、炎癥、自身免疫病等多種疾病相關[2]。瘢痕疙瘩的發(fā)生類似于良性腫瘤[1]，本研究通過檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中GRP94蛋白的表達，探討GRP94在瘢痕疙瘩形成過程中的作用。

1材料和方法

1.1 標本來源： 所用標本均來自本科手術的患者，瘢痕疙瘩12例，其中男性3例，女性9例；患者年齡21～52歲，平均38.2歲；正常皮膚12例，其中男性4例，女性8例，患者年齡21～67歲，平均40.8歲，為整形美容手術棄用的皮膚。所有取材均獲得患者知情同意，取材前均未經藥物治療，且取材部位無破潰、感染、腫瘤等其他疾病。標本取材后，迅速在液氮中凍存。

1.2 主要試劑： 兔抗人GRP94多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、兔抗人Actin多克隆抗體（Santa Cruz，美國）、ECL Plus 發(fā)光液（Amersham ， 美國）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。

1.3 免疫組織化學染色： 冰凍切片6μm，4℃丙酮固定10h。采用SP免疫組化試劑盒染色，DAB顯色試劑盒顯色，操作步驟按照試劑盒說明書進行。一抗（GRP94多抗）稀釋度為1:300，以PBS代替一抗作陰性對照。陽性為胞質或胞核棕黃色著色，陰性不著色。

免疫組化染色結果的數(shù)據采集： 表皮GRP94＋角質形成細胞著色強度的評估：用CMIAS2001B病理圖像采集分析系統(tǒng)對兩組標本進行圖像采集，每例標本在放大400倍的條件下采集5個不重疊視野，測定平均光密度值，計算每組平均值，反映GRP94的表達。

真皮中GRP94＋成纖維細胞的計數(shù)： 用武漢產目鏡帶格式顯微測微尺，在放大400倍的條件下，每例樣本檢測10個視野，分別計數(shù)各例標本真皮層中陽性成纖維細胞的數(shù)目。

計算公式為：細胞數(shù)/mm2＝細胞總數(shù)÷視野數(shù)（10）÷格式目鏡測微尺的面積（0.005mm2）。

1.4 免疫印跡實驗：取手術切下的皮膚組織，保留表皮，用三去污裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取20μg總蛋白溶液，與5×SDS上樣緩沖液混勻，沸水浴變性5min，10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳80V×2h，電轉膜70V×2h，5％脫脂奶粉封閉3h，一抗（GRP94多抗，1:200；Actin多抗，1:500）孵育，4℃過夜，二抗孵育（1:5000）1h，ECL plus暗處顯色5min，X光膠片曝光、顯影、定影。

免疫印跡實驗結果的數(shù)據采集： 英國Syngene凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析GRP94和Actin條帶的灰度值，兩者比值代表每例樣本GRP94的相對含量。

1.5統(tǒng)計學處理：每組病例平均光密度值、細胞計數(shù)或蛋白表達相對含量的數(shù)據以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗作組間比較，P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1 GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中的表達部位：GRP94主要在角質形成細胞、成纖維細胞、炎癥細胞和血管內皮細胞及皮膚附屬器的毛囊、汗腺、皮脂腺的胞漿表達，在兩組中均可見GRP94在少數(shù)細胞的胞核中表達（圖1～3）。

2.2 GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織表達量的變化：免疫組化結果顯示GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織表皮的表達量無顯著性差異，P>0.05（表1）；在真皮中，瘢痕疙瘩GRP94陽性成纖維細胞數(shù)多于正常皮膚組，P<0.05（表1）。免疫印跡實驗結果表明GRP94在瘢痕疙瘩組中的平均表達量高于正常皮膚組，P<0.05（圖4，表1）。

3討論

在高溫、缺氧、饑餓等各種應激作用下機體細胞可以通過誘導特異性蛋白的產生（包括HSP和GRP等）對環(huán)境及生理應激產生應答。葡萄糖調節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP)是在應激狀態(tài)下細胞內質網明顯表達的一類應激蛋白。GRP94位于內質網腔、細胞表面等，是內質網應激的標志分子之一，具有多種重要的生物學功能[2]。本實驗中GRP94蛋白主要在皮膚組織的角質形成細胞、成纖維細胞、炎癥細胞、血管內皮細胞以及皮膚附屬器的毛囊、汗腺、皮脂腺的胞漿表達，在各組中均可見少數(shù)細胞的胞核中也有表達。該結果與GRP94在少數(shù)食管癌[3]、肝癌[4]等細胞的核中表達的報道相類似，其表達的意義尚待進一步的研究。

有文獻報道GRP94的表達與食管鱗癌、結腸癌、肝癌的分化、發(fā)展、血管浸潤及轉移存在明確的關系，分化越低GRP94表達水平越高[4-6]。可能與GRP94能抵抗低氧誘導的細胞凋亡，增強腫瘤細胞的存活能力[7]有關。GRP94的表達水平與腫瘤細胞的增殖和侵襲能力都呈一定的正相關。瘢痕疙瘩局部組織處于低氧[8]，具有長時間不能自行消退的生物學特征（類似于腫瘤樣改變）[1]，本實驗GRP94在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量明顯高于正常皮膚，提示瘢痕疙瘩組織低氧等應激因素引起的成纖維細胞發(fā)生內質網應激反應是瘢痕疙瘩中GRP94高表達的誘因，同時過度表達的GRP94抵抗細胞凋亡，導致細胞增殖旺盛，造成了局部低氧的微環(huán)境，如此惡性循環(huán)可能是瘢痕疙瘩不斷增生的原因所在。與腫瘤侵襲力正相關的GRP94的高表達可能是引發(fā)瘢痕疙瘩組織超過原損傷部位向周邊正常組織浸潤的機制之一。

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[收稿日期]2007-05-11 [修回日期]2007-08-13

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>