中藥美白祛斑藥效實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

The development of the study on pharmacodynamic action research of whritenning and removeing speckle by TCM

邵秋蓮 綜述，鐘曉明 審校

色素沉著性皮膚病如雀斑（遺傳性）、黃褐斑（內(nèi)分泌性）、曬斑（炎癥性）、瑞爾黑變?。ùx性）等因影響美觀， 越來越多的患者迫切要求治療，因而產(chǎn)生大量的美白祛斑產(chǎn)品，其中中藥美白產(chǎn)品以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)（安全，刺激性小，副作用?。┍妒軞g迎。但是，目前還沒有建立完整、系統(tǒng)的美白祛斑藥效研究方法及產(chǎn)品效能評(píng)價(jià)體系。本文就中藥美白祛斑藥物藥效實(shí)驗(yàn)研究及進(jìn)展綜述如下：

1皮膚黑素形成機(jī)理及美白機(jī)理

1.1 皮膚黑素形成機(jī)理：黑素的形成過程，存在于黑素細(xì)胞組織中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下經(jīng)多巴、多巴醌、多巴色素、二羥基吲哚等中間體逐步轉(zhuǎn)化為真黑素，進(jìn)而黑素細(xì)胞組織將黑素轉(zhuǎn)移到表皮基底層細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的新陳代謝而被帶到角質(zhì)層中，最后隨角質(zhì)化細(xì)胞脫落[1]。但是由于受紫外線、遺傳、內(nèi)分泌、炎癥介質(zhì)、飲食不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?，黑素代謝異常，皮膚黑素過快增長(zhǎng)和分布不均，就會(huì)造成局部皮膚過黑及色素沉著，表現(xiàn)為黃褐斑、雀斑和炎癥后色素沉著等[2]。

1.2 美白機(jī)理

1.2.1 改善異常的血液流變學(xué)：黃褐斑是一種常見的色素沉著性皮膚病，《醫(yī)宗金鑒》認(rèn)為本病“源于憂思抑郁，血弱不華，火燥結(jié)滯而生于面上，婦女多有之”?！锻饪普凇蠛诎摺吩弧镑蠛诎哒?，水虧不能制火，血弱不能華肉，以致火燥結(jié)成斑黑，色枯不澤”。本病的產(chǎn)生與肝、脾、腎三臟關(guān)系甚密，而“氣血瘀滯，經(jīng)絡(luò)不通氣血不能上榮于面”是黃褐斑的主要病機(jī)[3]。選用藥物時(shí)，眾醫(yī)家多以活血化瘀為先導(dǎo)。活血化瘀法可疏通瘀阻，使氣機(jī)得以流暢，促進(jìn)面部血液循環(huán)，改善面部皮膚代謝，使面部色素逐漸消散。臨床上采用活血化瘀法治療黃褐斑取得了較好的療效。林新瑜等[4]檢測(cè)黃褐斑患者全血粘比、血漿粘度、血沉、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞電泳、纖維蛋白原等含量，并與正常對(duì)照組比較，結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性差異。所以認(rèn)為血液流變學(xué)的改變與黃褐斑的發(fā)生關(guān)系密切。

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性及黑素細(xì)胞的增殖及合成：皮膚黑素抑制機(jī)理是美白機(jī)理的核心內(nèi)容，可通過抑制酪氨酸酶活性或者阻斷酪氨酸生成黑素的氧化途徑，從而減少黑素的生成達(dá)到美白祛斑的效果。

1.2.3 提高機(jī)體超氧化歧化酶(SOD)活性、清除多余超氧自由基：黑素的生成過程是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，該過程除與酪氨酸酶有關(guān)外，還與自由基等因素密切相關(guān)[5]。研究表明，酪氨酸酶的催化作用和多巴醌及其以后的自動(dòng)氧化反應(yīng)均需自由基的參與，自由基數(shù)目減少可減少黑素的生成[6]。王國(guó)麗等的實(shí)驗(yàn)顯示黃褐斑患者治療后血清中SOD含量明顯降低、丙二酮(MDA)含量升高。從而提出OFR與皮膚黑素的形成及色素沉著有關(guān)?？寡趸瘎㏒OD能有效清除多余超氧自由基，使LP0、MDA形成減少，從而阻止黃褐斑的產(chǎn)生。

2美白祛斑實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞選擇

2.1.1.1 正常人黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)：李誠(chéng)讓等[7]取環(huán)切術(shù)切下的包皮作為標(biāo)本進(jìn)行不同濃度的中藥單體蘆薈素對(duì)體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞的影響觀察。采用人表皮的正常黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系雖然接近人體實(shí)際生理情況，但是成人表皮中黑素細(xì)胞含量極少，基底層的黑素細(xì)胞數(shù)平均為1 560/mm2，只占表皮細(xì)胞的2%。正常情況下，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、增殖能力極為有限，容易被角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染，能得到的黑素細(xì)胞量少，限制了黑素細(xì)胞的臨床應(yīng)用。但可以在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中添加促黑素細(xì)胞生長(zhǎng)因子以刺激其增殖。

2.1.1.2 活體動(dòng)物皮膚內(nèi)的黑素細(xì)胞：中藥外涂于動(dòng)物的皮膚，作用一段時(shí)間后，取動(dòng)物表皮中的黑素細(xì)胞并研究其變化，這種方法最接近真實(shí)情況[8]。過偉峰等[9]用黃體酮注射液攻擊雌性小鼠，同時(shí)灌服克斑膠囊，通過檢測(cè)皮膚黑素細(xì)胞的消長(zhǎng)情況等來探討克斑膠囊治療黃褐斑的療效及其作用機(jī)理。

2.1.1.3 永生化黑素細(xì)胞株：正常組織來源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可生長(zhǎng)和分裂，但經(jīng)過有限次的細(xì)胞傳代后，就會(huì)停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，這就限制了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，學(xué)者們常用永生化的黑素細(xì)胞株作為研究對(duì)象來研究中藥的藥理作用[8]。常用的有Melan-a鼠黑素細(xì)胞株、小鼠永生化黑素細(xì)胞株B10BR。Melan-a鼠黑素細(xì)胞株來源于新生C57BL鼠皮膚的永生化二倍體黑素細(xì)胞，基因型為agouti/agouti（純合子，顯性），該細(xì)胞保留了正常黑素細(xì)胞的特征，體外無(wú)限增生依賴十四烷佛波酯（TPA）；Melan-a鼠黑素細(xì)胞株接種到同系小鼠或裸鼠身上，不能誘發(fā)黑素瘤的發(fā)生，該細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于研究黑素轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物對(duì)黑素合成的影響等方面。Melan-a鼠黑素細(xì)胞株比B16F10、S91等黑素瘤細(xì)胞株更接近于普通黑素細(xì)胞[10]。李永偉等[11]在觀察siRNA抑制InnVit基因后對(duì)鼠黑素細(xì)胞黑素合成的影響實(shí)驗(yàn)中采用了小鼠永生化黑素細(xì)胞株B10BR。

2.1.1.4 黑素瘤細(xì)胞：在人體原代皮膚黑素細(xì)胞培養(yǎng)非常困難的情況下，很多科研單位在篩選美白劑的過程中也廣泛采用黑素瘤細(xì)胞。常用的有鼠B16黑素瘤細(xì)胞株[12]、鼠黑素瘤Cloudman S91細(xì)胞株[13]、 A375人黑素瘤細(xì)胞[14]。在研究中藥對(duì)黑素合成的抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)常選用鼠B16黑素瘤細(xì)胞株，它是一種實(shí)體黑素瘤細(xì)胞株。康琰琰等[12]采用小鼠B16黑素細(xì)胞為受試細(xì)胞，分別研究藥物對(duì)黑素細(xì)胞的細(xì)胞毒性、酪氨酸酶活性和黑素合成的影響。鼠黑素瘤Cloudman S91細(xì)胞株一般在中藥促進(jìn)黑素合成的研究中選用較多。A375人黑素瘤細(xì)胞是一種人惡性黑素瘤細(xì)胞株。

2.1.1.5黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系：黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)在體外模擬“表皮黑素單元”，更符合表皮的生理學(xué)特點(diǎn)。Nicolay等使用共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察到被廣泛用于化妝品組成的L-酪氨酸衍生物對(duì)于UV引起的黑素生成呈現(xiàn)劑量依賴性刺激作用，精氨酸則通過使黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生適量的NO而促進(jìn)UV引起的黑素合成。國(guó)內(nèi)尚沒有中藥對(duì)共培養(yǎng)體系影響的任何報(bào)道[15]。2.1.2 檢測(cè)對(duì)黑素細(xì)胞生物活性的影響：馬晶波等[16]通過研究添加旱金蓮提取物后對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性等的測(cè)定發(fā)現(xiàn)旱金蓮提取物有抑制黑素合成的功效。采用以L-多巴為底物，參考NakajimaM等方法測(cè)定細(xì)胞酪氨酸酶活性?？电萚12]采用幾種天然活性物質(zhì)對(duì)黑素合成影響的進(jìn)行研究，采用了經(jīng)典的MTT法來測(cè)細(xì)胞增殖率。楊亞軍等[2]在研究天然活性物對(duì)黑素形成的影響時(shí)采用了NaOH溶解法測(cè)定黑素含量。牟寬厚等采用微孔濾膜分析法研究了首烏提取物對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，皮膚受紫外線照射后，其角質(zhì)細(xì)胞會(huì)作出反應(yīng)，并釋放出一種稱為內(nèi)皮素的物質(zhì)。內(nèi)皮素與黑素細(xì)胞膜受體結(jié)合會(huì)促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖，合成更多的黑素及新的DNA，以對(duì)抗紫外線的照射[1]。bFGF是一種堿性多肽細(xì)胞生長(zhǎng)因子，既往研究發(fā)現(xiàn)它是黑素細(xì)胞的重要促分裂劑，而且角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的bFGF在體內(nèi)可能是黑素細(xì)胞的自然生長(zhǎng)因子[17]。所以研究者也可以通過中藥作用于黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體中ET-1、bFGF的含量變化來進(jìn)行美白祛斑的效能評(píng)價(jià)。吳艷等采用westernblot和實(shí)時(shí)RT-PCR法分別測(cè)黑素細(xì)胞酪氨酸酶及酪氨酸酶相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)桂枝可以抑制酪氨酸酶mRNA表達(dá)，減少這種限速酶的蛋白產(chǎn)量，有很強(qiáng)的抑制黑素產(chǎn)生的作用。

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1黃褐斑動(dòng)物模型的治療實(shí)驗(yàn)[18]：用紫外線照射或給予黃體酮的方法復(fù)制黃褐斑模型，以皮膚病理學(xué)檢查和黑素細(xì)胞多少等檢測(cè)受試藥物的治療作用[18]。周繼剛等[19]在探討祛斑膠囊的藥理作用時(shí)采用黃體酮致大鼠“黃褐斑”，測(cè)定其血液流變學(xué)變化和大鼠皮膚、肝臟中丙二醛、酪氨酸和超氧化物歧化酶含量，得出祛斑膠囊能顯著抑制酪氨酸酶活性，降低大鼠血粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)，降低大鼠皮膚、肝臟中丙二醛、酪氨酸含量，升高超氧化物歧化酶含量，對(duì)黃褐斑具有良好的治療作用。李洪武等選擇UVB照射豚鼠背部皮膚并涂藥3周后組織活檢取材，采用半定量RT-PCR檢測(cè)藥物干預(yù)前后豚鼠皮膚中酪氨酸酶m-RNA表達(dá)水平。胡軍等[20]對(duì)外涂“祛斑霜”的小鼠局部皮膚組織液中SOD活性進(jìn)行檢測(cè)分析并與空白組比較，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠用藥處皮膚組織液SOD活性均明顯增高，表明提高機(jī)體SOD活性，清除多余超氧自由基，減少黑素形成，是“祛斑霜”治療黃褐斑的作用機(jī)制之一。

3討論

色素沉著性皮膚問題越來越引起人們的重視。我國(guó)用中草藥治療和護(hù)理各種皮膚疾病已有幾千年的歷史。近年來，出于對(duì)化學(xué)美白祛斑產(chǎn)品毒性、刺激性的疑慮，越來越多的科學(xué)研究者傾向于從天然植物中尋找安全高效的美白活性物質(zhì)。

總體上說，中藥美白祛斑實(shí)驗(yàn)研究可以從細(xì)胞生物學(xué)、整體動(dòng)物、組織器官水平去考慮。結(jié)合美白祛斑原理，研究者可以做黑素細(xì)胞生物學(xué)、抗氧化、抗衰老、清除氧自由基等實(shí)驗(yàn)研究。在美白祛斑產(chǎn)品的效能評(píng)價(jià)時(shí)，還可做抗炎、防曬實(shí)驗(yàn)，若能消除紫外線及各種炎癥因子對(duì)黑素形成的刺激作用也能提高產(chǎn)品美白祛斑效能。通過以上系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，可以進(jìn)行美白祛斑中藥的篩選、藥效實(shí)驗(yàn)研究以及產(chǎn)品的美白祛斑效能評(píng)價(jià)，以便更好地促進(jìn)中藥美白祛斑產(chǎn)品的開發(fā)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]徐 良，步 平.美白祛斑化妝品及其未來發(fā)展[J].日用化學(xué)工業(yè)，2001，31（2）:42-45.

[2]楊亞軍，林 莉，丁家宜，等.天然活性物美白功效的細(xì)胞生物學(xué)研究[J].日用化學(xué)工業(yè)，2002，32（3）：19-21.

[3]李英松.黃褐斑的病因病機(jī)及其辨證施治[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2003，17（4）：281.

[4]林新瑜，周光平，李利，等.女性黃褐斑患者的血清酶學(xué)及血液流變學(xué)初步分析[J].臨床皮膚科雜志，1997，26(6): 359.

[5] 傅國(guó)強(qiáng)，馬鵬程，吳勤學(xué).21味中藥乙醇提取物的超氧化物歧化酶樣活性的研究[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2006，22（2）：134-136.

[6]Sanchez-Ferrer A，Rodriguez-Lopez JN，Garcia-Canovas F，et al.Tyrosinase: acomprehensive review of it smechanism[J]. BBA，1995，1247:1-11.

[7]李誠(chéng)讓，朱文元，王大光，等.蘆薈素抑制人表皮黑素細(xì)胞酪氨酸酶的最佳濃度選擇[J].臨床皮膚科雜志，2006，35（8）:506-508.

[8]常淑彪，李永偉，許愛娥.中藥對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)活性影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2006，5（4）:247-249.

[9]過偉峰，徐 立，項(xiàng)曉人，等.克斑膠囊治療黃褐斑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2001，8（1）:43-48.

[10]魯 嚴(yán)，朱文元，譚 城，等.蘆薈素對(duì)Melan-a鼠黑素細(xì)胞株黑素生成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].臨床皮膚科雜志，2003，32(9)：502-505．

[11]李永偉，張迪敏，劉東銀，等.InnVit基因沉默對(duì)黑素細(xì)胞B10BR黑素合成和細(xì)胞凋亡的影響[J]．中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2007，21（1）：3-4.

[12]康琰琰，張美英，邢少璟，等．幾種天然活性物對(duì)黑色素細(xì)胞毒性及美白功效的比較[J].日用化學(xué)工業(yè)，2005，35（6）：361-363.

[13]馬慧軍，朱文元，王大光.胡椒堿等6種中藥單體促進(jìn)黑素瘤Cloudman S91細(xì)胞株黑素合成的研究[J].臨床皮膚科雜志，2004，33(4):145-147．

[14]夏 俊，陳治文，胡守芬，等．蘆筍提取液抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的研究[J]．蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29(2)：95-97．

[15]張迪敏，李永偉，許愛娥.黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2005，14（2）：236-238.

[16]馬晶波，黃嵐，馮淑芳，等.旱金蓮提取物祛斑作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2003，37（5）:56-58.

[17]Akiyama M，Smith LT， Holbrook KA.Growth factor and growth factor receptor localization in the hair follicle bulge and associated tissue in human fetus[J].J Invest Dermatol，1996，106(3):391-396.

[18]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].2版.人民衛(wèi)生出版社，2006:1162.

[19]周繼剛，汪鑒植，陳仁美，等.祛斑膠囊治療黃褐斑的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2006，28（5）:15-17.

[20]胡 軍，孔 力，魯春光，等.“祛斑霜”治療黃褐斑作用機(jī)制的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（2）：112-113.

[收稿日期]2007-06-18 [修回日期]2007-08-20

編輯/李陽(yáng)利

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文?！?/p>