豬皮膚撕脫傷ＣＤ１８的表達(dá)與組織繼發(fā)性壞死的研究

[摘要]目的：研究豬皮膚撕脫傷組織中整合素CD18的表達(dá)及中性粒細(xì)胞的趨化，探討CD18在皮膚撕脫傷組織繼發(fā)性壞死中的作用。方法：復(fù)制豬皮膚撕脫傷模型，采用RT-PCR方法檢測傷后不同時(shí)間撕脫組織中CD18mRNA的表達(dá)；用髓過氧化酶(MyeloperoxidaBe enzyme，MPO)法測定組織中中性粒細(xì)胞數(shù)量，研究傷后撕脫組織中中性粒細(xì)胞的趨化情況。結(jié)果： ①傷后撕脫組織中CD18mRNA的表達(dá)逐漸升高，12h達(dá)峰值，24h后有所下降，受傷2h后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組CD18mRNA的表達(dá)明顯高于對照組（P<0.05）。 ②MPO傷后2h開始升高，12h達(dá)峰值，24h無明顯下降趨勢， 受傷2h后實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)MPO活性明顯高于對照組（P<0.01）。結(jié)論： 皮膚撕脫傷傷后早期組織中整合素CD18呈高表達(dá)，其變化與組織中中性粒細(xì)胞的趨化呈正相關(guān)，提示CD18在皮膚撕脫傷早期組織繼發(fā)性壞死中可能發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞]皮膚撕脫傷；CD18；中性粒細(xì)胞；髓過氧化酶

[中圖分類號]R619.6[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）09-1175-03

The expression of CD18 and tissues secondary necrosis in skin avulsion injure of swine

Song Bao-qiang1，Guo Shu-zhong1，HU Ya-lan2，Han Yan1，LI Yu3

(1.Institute of Plastic Surgery of Chinese PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Department of Plastic Surgery，260 Hospital，the Bethune Military Medical College，Shijiazhuang 050041，Hubei，China;3.Department of Pathology，the Fourth Military Medical University.)

Abstract: Objective To investigate the expression of CD18 and the tendency of neutrophil in avulsed skin tissues of swine， and to discuss the effect of CD18 on secondary tissues necrosis of skin avulsion injury. Methods The animal model of skin avulsion injury was replicated， and the expression of CD18mRNA in avulsed skin tissues was detected by RT-PCR method; and the amount of neutrophilic granulocyte in tissues was detected by MPO method in order to analyze the tendency of neutrophil of avulsed tissues after trauma.Results①The expression of CD18mRNA in avulsed tissues after trauma gradually increased， reached its peak value at the 12th hour， and then decreased slightly in the following 12 hours. The relative value of CD18mRNA of avulsed skin tissues in experiment group was markedly higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.05）. ②The activity of MPO in avulsed skin tissues in experiment group began to rise at the 2nd hour after trauma， and reached its peak value at 12th hour. No obvious decline occurred in the following 12 hours. The activity of MPO in experiment group was obviously higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.01）.ConclusionThe expression of CD18 in tissues is high during the early period of skin avulsion injury and its change is in positive correlation with the tendency of Neutrophil in tissues. It should be pointed out that CD18 may act an important role in secondary tissue necrosis of skin avulsion injury at the early stage.

Key words: skin avulsion injury; CD18; neutrophil; myeloperoxidase

皮膚撕脫傷是整形外科常見創(chuàng)傷，其組織繼發(fā)性壞死機(jī)制的研究是該類損傷基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用，其中CD18所介導(dǎo)在中性粒細(xì)胞損傷在其中扮演了重要的角色[1-2]。由于皮膚撕脫傷傷后存在缺血再灌注的病理生理過程，因而CD18在撕脫傷中的作用也是我們關(guān)心的問題之一。本研究擬通過對受傷組織中CD18的表達(dá)及中性粒細(xì)胞趨化的研究，探討粘附分子CD18在皮膚撕脫傷組織繼發(fā)性壞死中的作用。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組：選擇檢疫后的白色小豬作為實(shí)驗(yàn)動物，共14頭，其中雌性6頭，雄性8頭，體重15～25kg，人工混合飼料喂養(yǎng)。將14頭小豬隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組7頭。

1.2 皮膚撕脫傷模型的復(fù)制及標(biāo)本的采集：實(shí)驗(yàn)組動物經(jīng)3%戊巴比妥鈉30mg/kg肌注麻醉后，豬后肢外側(cè)預(yù)撕脫部位備皮，將其固定于撕脫傷模型機(jī)上，按文獻(xiàn)[3]報(bào)道的參數(shù)復(fù)制皮膚撕脫傷。隨即將遭受創(chuàng)傷的小豬固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒鋪巾，用美藍(lán)于豬后肢撕脫區(qū)域設(shè)計(jì)一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，沿設(shè)計(jì)線切開皮膚、皮下，于深筋膜下掀起皮瓣，隨后再將其原位縫回。術(shù)后0、2、6、12、24h于皮瓣的中遠(yuǎn)1/3交界處采集組織標(biāo)本。對照組動物不經(jīng)模型機(jī)碾壓，直接于豬后肢通過手術(shù)形成一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，術(shù)后0、2、6、12、24h于皮瓣中遠(yuǎn)1/3交界處采集組織標(biāo)本。

1.3 組織中CD18mRNA的表達(dá)：采用RT-PCR 法檢測組織標(biāo)本中CD18mRNA的表達(dá)，用 Trizol 試劑（Gibco-BRL公司）分別提取實(shí)驗(yàn)組和對照組組織標(biāo)本中的總 RNA，用隨機(jī)引物將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并以β-Actin為內(nèi)對照。其中擴(kuò)增CD18基因的上游引物為5' TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3'；下游引物為：5' TgTTgATgCTggACgTgCAC 3'；PCR 條件為：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒（Promega公司）提供的說明書進(jìn)行，其中CD18的擴(kuò)增片斷為500bp，β-Actin的擴(kuò)增片斷為250bp， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，用UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并用Labworks軟件對各陽性條帶的密度進(jìn)行測定。利用PCR膠回收試劑盒（上海華舜生物技術(shù)公司）將PCR產(chǎn)物從凝膠上收回，進(jìn)一步亞克隆至PMD18-T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞、篩選、小量制備質(zhì)粒DNA后，用Sanger雙脫氧鏈終止法及測序試劑盒(Amer-sham)進(jìn)行序列測定。

1.4 組織中MPO活性測定：取撕脫組織0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺（Sigma公司）溶液2ml，用勻漿機(jī)（德國ART公司）勻漿。超聲細(xì)胞粉碎儀（英國SANYO MSE公司），（10s、3次）粉碎細(xì)胞及亞細(xì)胞成分。0～4℃，40000g離心15min。取上清0.1ml加反應(yīng)液2.9ml（磷酸鄰聯(lián)茴香胺16.7mg，50mmol/LPBS液10ml，蒸餾水90ml，加入30%過氧化氫，使最終濃度為0.0005%），分光光度計(jì)（HITACHI公司）460μm波長下立即進(jìn)行2min掃描。以第30s至90s 1min時(shí)間內(nèi)吸光度(OD值)的變化代表酶活力的改變。根據(jù)下列公式計(jì)算MPO活性單位（25°C下，每分鐘分解1μmolH2O2的MPO的量為1個(gè)MPO活性單位)，以反映組織中中性粒細(xì)胞的浸潤數(shù)量。MPO活性單位（×103U）/kg=（ΔA460/min）÷（11.3×所加組織量/L反應(yīng)液）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1組織中CD18mRNA的表達(dá)：凝膠電泳結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組各時(shí)間點(diǎn)均有陽性條帶，PCR產(chǎn)物從凝膠上回收擴(kuò)增后，序列測定顯示為整合素CD18的cDNA。利用Labworks軟件對各陽性條帶進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：兩組各陽性條帶的灰度值存在差異，而內(nèi)參照β-Actin的表達(dá)兩組間沒有差異(圖1)，兩組CD18 mRNA的表達(dá)均隨時(shí)間推移而逐漸升高，至12h達(dá)峰值，此后略有下降，撕脫2h后實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)CD18 mRNA的表達(dá)明顯高于對照組（圖2） (P<0.05)。

2.2組織中MPO活性的變化 實(shí)驗(yàn)組MPO活性于傷后逐漸升高，12h達(dá)峰值，對照組術(shù)后逐漸升高，6h達(dá)峰值，受傷2h后實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)MPO活性數(shù)值明顯高于對照組（P<0.01）。（表1）

3討論

皮膚撕脫傷是整形外科常見創(chuàng)傷，臨床救治中我們常會見到受傷的組織早期血運(yùn)良好，但原位縫回后，隨著時(shí)間的延長，會逐漸出現(xiàn)部分組織的壞死，即組織的繼發(fā)性壞死。由于引發(fā)壞死的機(jī)制尚不甚清楚，目前缺乏有效的應(yīng)對措施，也直接影響了皮膚撕脫傷的臨床救治效果，因而探索、研究組織繼發(fā)性壞死的機(jī)制，對于預(yù)防組織壞死、提高皮膚撕脫傷臨床救治效果有著重要的意義。為此我們已進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，并取得了一定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)撕脫組織中自由基增加、鈣離子超負(fù)荷、TXA2/PGI2、選擇素等的變化在組織繼發(fā)性壞死中扮演著重要角色[4-5]。

隨著研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)，撕脫組織在受傷的瞬間，來自基底及周圍的血液供應(yīng)被即時(shí)阻斷，血供來源僅依靠與本體相連的蒂部。由于血供方式的突然改變，大部分撕脫組織處于缺血狀態(tài)。隨著傷后時(shí)間的推移，組織血循環(huán)得以重新分布，處于缺血狀態(tài)的受傷組織再次得到血流灌注。但組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，受傷組織中出現(xiàn)大量的炎細(xì)胞浸潤，并有大量微血栓形成，最終導(dǎo)致了部分組織的壞死。這些繼發(fā)性組織病理改變是否與早期撕脫組織的再灌注損傷有關(guān)是值得我們進(jìn)一步關(guān)注的問題。已有的研究顯示，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[1]，其中整合素CD18所介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞損傷在其中扮演著重要角色，它與皮膚撕脫傷組織繼發(fā)性壞死的關(guān)系是本研究所關(guān)注的重點(diǎn)。

中性粒細(xì)胞含有MPO，每個(gè)細(xì)胞所含酶的量是一定的，約占細(xì)胞干重的5%，該酶具有還原過氧化氫的能力，利用此特點(diǎn)，通過分析組織中MPO的活力，就可以反應(yīng)組織中中性粒細(xì)胞的數(shù)量變化[6]。我們的研究也利用了中性粒細(xì)胞的這一特點(diǎn)，對受傷組織中中性粒細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，撕脫傷后隨著時(shí)間的延長，MPO活性明顯增高，提示受傷組織中有大量的中性粒細(xì)胞聚集，這與組織學(xué)研究的結(jié)果完全一致[3]。MPO動態(tài)變化顯示，受傷組織中中性粒細(xì)胞的趨化在傷后12h達(dá)到了高峰，24h后仍無明顯下降趨勢。已有研究表明：中性粒細(xì)胞在組織和臟器的大量聚集和過度活化會對宿主產(chǎn)生破壞作用，釋放大量毒性氧自由基和蛋白水解酶，導(dǎo)致血管通透性增加、組織水腫等一系列病理變化[7-9]；同時(shí)被激活的中性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮，引起毛細(xì)血管前括約肌和后微靜脈損傷，流通受阻的中性粒細(xì)胞發(fā)生堆積，阻塞毛細(xì)血管，加重缺血損傷，最終導(dǎo)致局部組織的壞死。根據(jù)MPO的檢測結(jié)果，我們推測，皮膚撕脫傷早期，中性粒細(xì)胞向受傷組織的大量聚集可能是引發(fā)組織繼發(fā)性壞死的重要原因之一。

有關(guān)組織再灌注損傷的進(jìn)一步研究顯示，中性粒細(xì)胞對組織的損害作用呈粘附依賴性，即依賴于中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，而這種粘附作用主要是通過中性粒細(xì)胞表面粘附蛋白CD18介導(dǎo)完成。通常情況下，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間親和力較弱，相互間很少發(fā)生粘附，即使粘附也會很快分開，可能是與正常情況下粘附分子表達(dá)較弱有關(guān)。特定條件下，如缺氧、創(chuàng)傷等因素的刺激，粘附分子的表達(dá)可能會增強(qiáng)，甚至過度表達(dá)[10]，這種高表達(dá)為粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附提供了有力的支持。我們針對皮膚撕脫傷撕脫組織CD18的檢測顯示，撕脫傷后，受傷組織中CD18mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，其表達(dá)隨著時(shí)間的延長與中性粒細(xì)胞的趨化呈正相關(guān)，提示這種高表達(dá)與組織中中性粒細(xì)胞的趨化、粘附密切相關(guān)。在此過程中由于中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附所導(dǎo)致的粒細(xì)胞活化和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷引發(fā)了一系列的病理生理改變，包括毛細(xì)血管通透性增大、組織水腫及大量微血栓形成等，最終導(dǎo)致組織的壞死[11-12]。

本研究結(jié)果提示：整合素CD18在皮膚撕脫傷早期呈高表達(dá)，這種高表達(dá)CD18可能在組織繼發(fā)性壞死中發(fā)揮著重要作用。在創(chuàng)傷早期，特別是傷后12h內(nèi)，有針對性地進(jìn)行CD18的拮抗治療，將有效抑制中性粒細(xì)胞過度趨化、粘附所造成的組織壞死，對皮膚撕脫傷組織繼發(fā)性壞死起到積極的預(yù)防作用。

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[收稿日期]2007-05-14 [修回日期]2007-08-11

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>