血管組織工程的進(jìn)展

Vascular tissue engineering

血管病變尤其是冠狀動(dòng)脈的閉塞性病變?yōu)槿祟惖闹饕∷涝蛑?。其主要的治療方法是血管搭橋手術(shù)，需要各種直徑的血管移植物作為修補(bǔ)材料。臨床已經(jīng)應(yīng)用的血管移植物包括自體血管、異體血管和合成材料管道。然而目前無論那種血管移植物都無法滿足臨床需要，臨床需要一種新的血管替代物，這種管道應(yīng)具有高度的組織相容性、可生長性及外科易操作性，且應(yīng)無排異反應(yīng)、無血栓形成、不易感染等優(yōu)勢，移植后能維持管腔的長期通暢，從而提高血管移植手術(shù)的長期療效。組織工程學(xué)的出現(xiàn)為這種血管移植物的研發(fā)提供了可能。但血管的組織工程研究仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)：良好的血管替代物要求有足夠的強(qiáng)度以免在血壓變化時(shí)出現(xiàn)破裂；要有彈性來承受循環(huán)負(fù)荷；要與臨近的自體血管有良好的愈合性能；還要有完整健康的內(nèi)膜層，以防止血栓的形成。目前很多組織工程化的組織，例如骨、軟骨等的構(gòu)建過程依賴于在受體體內(nèi)隨時(shí)間推移而逐漸達(dá)到組織重塑并最終獲得功能，而組織工程化的血管必須在移植的同時(shí)就具有完全的結(jié)構(gòu)和功能。這就要求在體外培養(yǎng)出具有生命力和良好性能的血管替代物，因此血管組織工程研究難度大大增加。本文就血管組織工程的進(jìn)展綜述如下：

1組織工程血管移植物研究的歷史

實(shí)際上，在組織工程概念提出以前，心臟外科和血管外科的臨床醫(yī)生及很多研究人員就已應(yīng)用某些類似今天組織工程所使用的方法來獲得更好的血管替代物。從血管組織工程的發(fā)展來看，可以分為以下幾個(gè)方面：

1.1非降解合成材料表面的內(nèi)皮化:非降解合成材料人工血管研制成功，使其在大、中動(dòng)脈代用方面取得較好的效果，但在小口徑動(dòng)脈（<6 mm）和靜脈移植上的療效仍然不佳，這與血管代用物管徑細(xì)和血流速度緩慢，極易發(fā)生血栓栓塞有關(guān)。因此人們設(shè)想通過組織培養(yǎng)技術(shù)使之在人工血管內(nèi)面實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化，可使此類移植物的功能得到實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)。國內(nèi)汪忠鎬等[1-2]從20世紀(jì)80年代就開始了這方面的研究。后來又通過從脂肪組織中來提取微血管內(nèi)皮細(xì)胞。隨后干細(xì)胞也被誘導(dǎo)分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，成為內(nèi)皮種子細(xì)胞的來源之一[3-4]。為了提高血管腔內(nèi)內(nèi)皮化，人們對血管材料的表面進(jìn)行了修飾，以期提高內(nèi)皮細(xì)胞在其表面的粘附和生長，包括在表面衣被一些細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，如RGD、膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等 [5-6]。Deutsch[7]將內(nèi)皮細(xì)胞種植于包被有纖維粘連蛋白的ePTFE后，用于股腘旁路搭橋手術(shù)，獲得了68%的通暢率。在對ePTFE進(jìn)行內(nèi)皮化的時(shí)候應(yīng)用了體外的模擬脈動(dòng)灌注系統(tǒng)來提高血管內(nèi)皮化。

但是這種種植內(nèi)皮細(xì)胞的人工血管也存在不可克服的缺點(diǎn)。非降解材料的使用會(huì)阻礙正常血管結(jié)構(gòu)的形成，也就是說ePTFE和Dacron等阻礙了血管細(xì)胞形成膠原和彈性蛋白。因此，在血管的長期應(yīng)用過程中這些合成材料將成為物理障礙。同樣，由于合成材料的存在，血管活性成分將完全喪失，這種血管不具有正常的舒縮功能，最終因內(nèi)膜增生而導(dǎo)致堵塞?？梢哉J(rèn)為，采用非降解材料做支架構(gòu)建的血管不是真正意義的組織工程血管，只是人造血管的表面改性。

1.2無支架的全細(xì)胞生物血管:1998年，L'Heureux等[8]構(gòu)建了一種全新的完全生物化的組織工程血管。該生物血管是完全用人的細(xì)胞生成的。在含有抗壞血酸的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)分別培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，使分別形成一薄的平滑肌細(xì)胞組織片和薄的成纖維細(xì)胞組織片，將它們分別纏繞在同一軸上，形成內(nèi)面是平滑肌細(xì)胞層、外面是成纖維細(xì)胞層的復(fù)合管。再在平滑肌細(xì)胞層內(nèi)表面種植內(nèi)皮細(xì)胞，這樣就形成了在結(jié)構(gòu)上與自體血管基本相似的具有三層結(jié)構(gòu)的血管移植物。培養(yǎng)后的這種血管替代物可以承受2 000mmHg的爆破沖擊力，還具有生物活性，能表達(dá)或分泌LDL、PGI2等物質(zhì)，非常接近自體血管。短期狗體內(nèi)植入試驗(yàn)表明其縫合性能良好，植入后這些血管替代物穩(wěn)定，在植入1周后能保持50%的通暢率。Heureux認(rèn)為這種全生物化的人工血管之所以能有良好的力學(xué)特性，在于它的細(xì)胞外基質(zhì)是培養(yǎng)細(xì)胞自己生成的，而且它是一個(gè)有生物活性可以自我更新的組織。由于沒有合成材料的參與，可以減低感染及機(jī)體免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，有利于提高遠(yuǎn)期通暢率。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示通過利用細(xì)胞特性和給予一定的培養(yǎng)時(shí)間可以使生成的血管移植物獲得較好的機(jī)械強(qiáng)度。但在移植后可觀察到有部分出現(xiàn)血栓，同時(shí)至少需要12周的時(shí)間才能獲得該血管替代物也是很大的制約。Heureux的工作于1998年發(fā)表后，被很多文獻(xiàn)所引用。但至今我們未能查到其后續(xù)的文章，也未查到其他人跟進(jìn)的文章。“無支架”有悖于組織工程學(xué)的基本原理，“無支架的全細(xì)胞生物血管”是否可行尚待更多實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

1.3細(xì)胞和生物可降解支架相結(jié)合的組織工程化血管移植物：目前血管組織工程學(xué)的研究主要集中在細(xì)胞和生物可降解支架相結(jié)合的組織工程化血管移植物上，它包括以下幾個(gè)方面：種子細(xì)胞的獲取和擴(kuò)增；生物可降解支架的研制和改性；生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用以及對各種細(xì)胞生物學(xué)特性和組織培養(yǎng)的全過程調(diào)控。

2用于組織工程血管種子細(xì)胞的獲取、擴(kuò)增及功能調(diào)控

細(xì)胞技術(shù)是血管組織工程的首要核心技術(shù)。在進(jìn)行組織工程化血管的構(gòu)建中，不但要有豐富的種子細(xì)胞而且細(xì)胞要具有正常的功能。

2.1細(xì)胞的獲取及擴(kuò)增:自從內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)獲得成功后，自體內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于血管組織工程的構(gòu)建。但自體細(xì)胞能獲取的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要，而且其擴(kuò)增的能力有限，在體外培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)退化，喪失功能。進(jìn)而人們希望通過某些生長因子的調(diào)控，促進(jìn)體外細(xì)胞擴(kuò)增。目前已經(jīng)證實(shí)，VEGF、 bFGF及TGF-β 等生長因子對血管內(nèi)皮細(xì)胞有明確的促進(jìn)增殖和遷徙的作用[9-10]。

盡管生長因子的應(yīng)用使得體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖獲得較大的增加，但其調(diào)控機(jī)制還沒有完全弄清楚，其使用的劑量及如何聯(lián)合使用多種生長因子以達(dá)到細(xì)胞的增殖需要仍是研究的焦點(diǎn)?？梢灶A(yù)見生長因子的應(yīng)用將是組織工程中必不可少的重要環(huán)節(jié)，對細(xì)胞增殖機(jī)制的研究也必將為生長因子的應(yīng)用帶來更為可觀的效果。雖然自體細(xì)胞沒有免疫排斥反應(yīng)，且研究人員正在應(yīng)用生長因子及其他方法來促進(jìn)其增殖，但由于體外擴(kuò)增的時(shí)間過長、細(xì)胞容易出現(xiàn)退化等問題，自體細(xì)胞目前仍無法滿足臨床需要，人們將目光集中在干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化上。目前骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的分化已經(jīng)獲得成功，長期培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞可向血管平滑肌細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)成平滑肌細(xì)胞[11]。然而，干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞后還需要較長期的培養(yǎng)才能制成功能性血管代用物，時(shí)間上的需求限制了臨床上很多急需血管代用物患者的應(yīng)用。為了解決這一問題，Matsumura G等[12]進(jìn)行了嘗試，他們分離提取自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞后直接接種于可降解的血管支架上，立即植入患者體內(nèi)，進(jìn)行先天性心血管畸形的修復(fù)手術(shù)。結(jié)果顯示所有患者均未出現(xiàn)栓塞或動(dòng)脈瘤破裂等致命并發(fā)癥。Shin'oka T等[13]也進(jìn)行了同樣的臨床研究，獲得了較好的效果。他們認(rèn)為將骨髓基質(zhì)細(xì)胞直接種植于可降解血管支架后直接植入體內(nèi)是一種理想的血管組織工程方法，有望代替目前常用的人工假體血管用于治療嚴(yán)重先天性心血管畸形的外科手術(shù)。但更長期的臨床觀察來證明其可行性仍舊是必要的。

2.2種子細(xì)胞的功能調(diào)控:在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及組織構(gòu)建的過程中，如何保持細(xì)胞的功能，防止其在體外增殖過程中出現(xiàn)退化，對于獲得與自體血管相近的血管代用物是十分重要的。在血管的構(gòu)建中主要是平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)控，因?yàn)檠艿膹?qiáng)度主要依靠中膜層。而要想維持良好的強(qiáng)度，就必須保證在支架材料降解以前平滑肌細(xì)胞有合適的密度并產(chǎn)生足夠量的細(xì)胞外基質(zhì)。因而如何促進(jìn)平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)的分泌就成為研究的重點(diǎn)。目前研究顯示，TGF-β1 能明顯促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的膠原表達(dá)[14]，而且還發(fā)現(xiàn)其具有抑制細(xì)胞增殖的作用，從而可以防止因平滑肌細(xì)胞過度增生導(dǎo)致的管腔狹窄[15]。種子細(xì)胞的功能調(diào)控目前仍處于初步階段，很多機(jī)制還沒有弄清楚，需要進(jìn)一步的研究和探索，希望能夠找到促進(jìn)細(xì)胞快速增殖同時(shí)又能保持良好功能的方法。

3生物可降解支架的研制和改性

在組織工程血管代用物的構(gòu)建中，涉及很多因素。其中重要的一個(gè)就是支架的選擇，可以肯定地講，材料上的突破將會(huì)給組織工程帶來革命性的發(fā)展。

3.1天然支架材料：構(gòu)建組織工程血管常采用的天然材料包括膠原蛋白和彈性蛋白等，以及目前研究較多的血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料。它們含有特殊氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）。RGD是一種可被細(xì)胞膜上的整合素受體識別的配體，有利于促進(jìn)細(xì)胞粘附。

3.1.1膠原材料：1986年，Weinberg等[16]首先建立了以動(dòng)物膠原蛋白和血管細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的血管模型。這種材料在較低的靜脈壓力下就發(fā)生破裂，它的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到植入體內(nèi)的要求。為了獲得強(qiáng)度更好的支架材料，人們把小腸粘膜下層（SIS）分離出來并進(jìn)行化學(xué)處理去掉細(xì)胞成分，僅留下主要為膠原的細(xì)胞外基質(zhì)。這種材料的力學(xué)強(qiáng)度明顯增加，基本能夠滿足組織工程的要求。Huynh等[17]研制了一種SIS管狀支架，在保持支架材料生物相容性的前提下，應(yīng)用最少的化學(xué)交聯(lián)將其同膠原層結(jié)合在一起來提供機(jī)械強(qiáng)度。血管移植物的內(nèi)表面用肝素處理防止血栓的形成，然后植入到兔體內(nèi)，13周內(nèi)所有的移植物均通暢，并且可以看到平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞從周圍長入移植物內(nèi)，此外這種移植物的縫合性能完全能滿足移植需要。當(dāng)移植物從體內(nèi)取出并給予一定的化學(xué)刺激時(shí)可以出現(xiàn)功能性的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)SIS的力學(xué)強(qiáng)度及移植后的效果明顯好于靜脈移植，但在進(jìn)行降主動(dòng)脈移植后6個(gè)月會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)張，考慮與彈性纖維合成不足有關(guān)[18-19]。羊膜也被認(rèn)為是進(jìn)行血管組織工程研究的一種比較理想的支架材料[20]。

3.1.2血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料:將異種的血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料應(yīng)用到組織工程血管的構(gòu)建中一直是研究的熱點(diǎn)。Teebken等[21]制備了豬的血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料，并將來自人大隱靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞種植在脫細(xì)胞基質(zhì)材料上，在體外灌注的條件下獲得單層內(nèi)皮細(xì)胞。這種材料提供了良好的細(xì)胞外基質(zhì)并且不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)和炎癥。Schaner 等[22]則用SDS（十二烷基磺酸鈉）將人的大隱靜脈脫細(xì)胞，靜脈內(nèi)的細(xì)胞去除達(dá)到94%以上，膠原及基底膜的結(jié)構(gòu)保持完好，其力學(xué)強(qiáng)度也可滿足血管移植的需要。

血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料具有較好的生物相容性和力學(xué)強(qiáng)度，但往往因?yàn)槔w維化的出現(xiàn)而導(dǎo)致失敗。而來自動(dòng)物的脫細(xì)胞基質(zhì)有可能傳播疾病以及人體對外來物質(zhì)的免疫反應(yīng)都是有待解決的問題。

3.2合成的生物降解材料：生物可降解的多聚體材料被設(shè)計(jì)成一個(gè)過渡的環(huán)境，它給將要形成的組織提供支持，它的降解速率與新組織的生成速率接近以便及時(shí)給細(xì)胞的生長和基質(zhì)的形成提供空間。多聚體材料為組織的生長提供三維的框架，保證了生成組織的結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性[23-24]。聚乙二醇酸（PGA）已被證實(shí)具有良好的生物相容性，在多種組織工程中被廣泛地應(yīng)用。1999年，Niklason等[25]第一次成功地證實(shí)合成的PGA材料在血管組織工程中的應(yīng)用是可行的。他們將牛動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞種植在PGA支架上，在脈動(dòng)流的生物反應(yīng)器條件下體外培養(yǎng)8周， PGA大部分降解，成功構(gòu)建了一條對藥物刺激有收縮反應(yīng)的血管。為了獲得更好的血管支架材料，人們將PHA與PGA共聚結(jié)合做成支架，也獲得了良好的性能，在力學(xué)強(qiáng)度及生物學(xué)特性上更接近自體血管[26]。

3.3合成材料的改性：為了獲得更好的生物相容性，人們對合成材料進(jìn)行了各種預(yù)處理及改性，以期能提高生物相容性。研究者們從材料學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)及醫(yī)學(xué)角度對這一問題進(jìn)行了深入的研究，目前研究主要集中于應(yīng)用一些細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，如膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等以及血清預(yù)處理PGA支架，結(jié)果顯示改性后能明顯提高細(xì)胞的粘附率[27-28]。Ratner等[29]認(rèn)為材料的表面修飾應(yīng)能做到不改變材料的機(jī)械特性與功能性，并且材料的生物相容性、生物可識別性或生物功能性均得到增強(qiáng)。通過在表面引進(jìn)位點(diǎn)固定生物分子或識別配基，可阻止細(xì)胞與材料之間非特異性相互作用和生物分子吸附。

隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白作用的過程其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞膜上整合素受體與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中配體特異性結(jié)合的過程，正是這種特異性的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了跨膜信號傳遞，從而促使細(xì)胞發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，并與材料發(fā)生粘附。在整合素上最常見的配體位點(diǎn)為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列，因此在組織工程血管材料表面共價(jià)結(jié)合（而非表面簡單涂附）RGD三肽或含有RGD序列的蛋白或多肽，與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生配體和受體的特異性結(jié)合應(yīng)是促進(jìn)粘附的較好方案之一。RGD有助于細(xì)胞粘附分化和增殖的作用目前已經(jīng)得到公認(rèn)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在不同的載體材料上結(jié)合RGD后均能明顯增加細(xì)胞的貼附率[30-31]。

3.4兩種材料的聯(lián)合應(yīng)用:可降解合成材料的預(yù)處理和改性使其具備了與天然材料類似的生物相容性，同時(shí)保留了合成材料良好的機(jī)械力學(xué)特性。但改性的過程非常復(fù)雜并且有可能帶來感染，改性應(yīng)用的細(xì)胞外基質(zhì)可能會(huì)帶來免疫反應(yīng)，在合成材料上細(xì)胞的生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在天然材料上的生長速度，這些都制約它的應(yīng)用。為了解決這一問題，人們把天然材料和人工合成材料結(jié)合起來，這樣就可以揚(yáng)長避短，獲得理想的血管支架。Furukawa等[32]首先進(jìn)行了嘗試，他們用聚乙醇酸（PLLA）做成多孔的支架，然后將平滑肌細(xì)胞和膠原溶液混合后種植于支架的孔隙內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示平滑肌細(xì)胞與載體的結(jié)合效率接近100%，明顯高于常規(guī)培養(yǎng)。Iwai等[33]將Poly(lactic-co-glycolic acid)與膠原海綿混合做成血管補(bǔ)片用來修補(bǔ)犬的肺動(dòng)脈，比較了進(jìn)行自體血管細(xì)胞接種與未行自體血管細(xì)胞接種兩組的情況。結(jié)果顯示6個(gè)月時(shí)兩組均無血栓形成，并且都形成了完整的單層內(nèi)皮和類似自體血管壁的組織結(jié)構(gòu)。說明兩種材料聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到預(yù)期的效果。

4生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和組織培養(yǎng)的調(diào)控

無論以何種方式培養(yǎng)細(xì)胞，如果不是以人工誘變?yōu)槟康?，其最根本的要求就是盡量在體外模擬該種細(xì)胞在生物體體內(nèi)的生長環(huán)境。而生長環(huán)境的某些偏差，如生長信號、化學(xué)信號、應(yīng)力信號的阻斷，要么導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，要么導(dǎo)致細(xì)胞正常形態(tài)或生理功能的喪失。同時(shí)，臨床上對組織工程化產(chǎn)品及治療的需求促使人們要研制出能精確調(diào)控并能大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量組織替代物的設(shè)備。因此，生物反應(yīng)器及其相應(yīng)技術(shù)被開發(fā)研制并應(yīng)用到組織工程當(dāng)中來。

人們?yōu)榱伺囵B(yǎng)出接近自體血管的組織，依據(jù)體內(nèi)環(huán)境設(shè)計(jì)了很多種生物反應(yīng)器。Kim BS[34]較早提出了動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的概念，即在旋轉(zhuǎn)或振蕩條件下種植培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞。與靜態(tài)種植比較，前者細(xì)胞附著的數(shù)量、分布的均勻度、生長情況和纖維蛋白的沉積都優(yōu)于后者。

在血管細(xì)胞種植培養(yǎng)時(shí)還應(yīng)考慮到血管在體內(nèi)要受到血液動(dòng)力學(xué)的影響，包括切變應(yīng)力、牽拉應(yīng)力和正應(yīng)力，這對細(xì)胞生長及功能發(fā)揮均有重要作用。Conklin 等[35]設(shè)計(jì)了一種簡單的用于組織工程血管構(gòu)建的脈動(dòng)灌注的生物反應(yīng)器。它由凸輪驅(qū)動(dòng)的注射器和蠕動(dòng)泵以及多個(gè)腔室組成，它的壓力維持在60～200mmHg，且不會(huì)影響到流動(dòng)的速度、流動(dòng)波幅及壓力的波幅。用這個(gè)帶脈動(dòng)灌注的生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬的頸總動(dòng)脈，結(jié)果檢測平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有良好的功能。Williams 等[36-37]在生物反應(yīng)器灌注條件下將平滑肌細(xì)胞種植于非編織的PGA材料上13天后再種植內(nèi)皮細(xì)胞，48h后可獲得完整連續(xù)的單層內(nèi)皮細(xì)胞層。并且在整個(gè)培養(yǎng)期間平滑肌細(xì)胞持續(xù)分泌膠原和彈性蛋白。在其后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長可以獲得較理想的功能性血管替代物。但以上實(shí)驗(yàn)的血管構(gòu)建所需時(shí)間長，長期的體外培養(yǎng)使得血管構(gòu)建的成功率極低，根本無法進(jìn)入到臨床應(yīng)用階段。Hoerstrup[38]專門設(shè)計(jì)了一個(gè)培養(yǎng)小口徑血管移植物的生物反應(yīng)器，應(yīng)用PGA/P4HB 合成材料作為血管支架，將血管成肌纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞種植在上面，通過4天的靜態(tài)培養(yǎng)后，將血管支架放在生物反應(yīng)器中并在一定的流速和壓力條件下培養(yǎng)，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，可以同時(shí)培養(yǎng)4根血管。在生物反應(yīng)器內(nèi)采用膠原支架進(jìn)行混合培養(yǎng)也獲得了性能較好的組織工程化血管[39]。

盡管生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)越來越接近體內(nèi)環(huán)境，但它仍然無法完全模擬血管在體內(nèi)生長的環(huán)境。由此人們設(shè)想能否將血管培養(yǎng)生長在體內(nèi)進(jìn)行，把體內(nèi)作為一個(gè)天然的生物反應(yīng)器，這樣有望獲得與自體血管完全接近的組織工程化血管。Chue等[40]進(jìn)行了嘗試，他們將可降解的聚羥基乙酸支架和非降解的聚丙烯網(wǎng)植入狗的胸腔和腹腔。3周后取出檢測，在支架上可見生長了一層厚約1～1.5mm的組織，鏡下可見多層的成肌纖維細(xì)胞和單層的內(nèi)皮細(xì)胞，成肌纖維細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白染色陽性。將支架去除后的組織管的抗爆破壓力達(dá)到2 500mmHg，縫合張力達(dá)到11.5N。將其植入同一條狗的股動(dòng)脈3～6.5個(gè)月，檢測發(fā)現(xiàn)其內(nèi)腔被覆一層內(nèi)皮樣細(xì)胞。他們認(rèn)為大動(dòng)物的胸、腹腔可以作為生物反應(yīng)器來培養(yǎng)用于血管移植的替代物。

總之，生物反應(yīng)器的研制開發(fā)及相應(yīng)調(diào)控技術(shù)的發(fā)展是血管組織工程的基本因素，如何提高其性能并改進(jìn)調(diào)控方式使其更加接近體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)出接近自體血管的替代物，是需要研究人員不斷努力和探索的。

5血管組織工程的挑戰(zhàn)及展望

在過去的二十年中，血管組織工程領(lǐng)域取得了巨大的成就，但也仍然存在很多問題和挑戰(zhàn)。什么是組織工程化血管必需的功能要求？很明顯，不形成血栓是最基本的。但是否需要具有血管活性？這一直是個(gè)存在爭論的問題，如果要想獲得與自體血管相近的血管替代物，那么一定要有血管活性。但如果血管移植物一直保持通暢，那么血管活性就不是必需的。Deutsch 等[7]展示了用內(nèi)皮細(xì)胞種植的ePTFE血管移植物保持了9年良好的通暢。另一個(gè)問題是血管的機(jī)械強(qiáng)度，血管替代物必需有一定的抗爆破壓力來保證安全，但是否必需和自體血管一樣擁有相當(dāng)?shù)恼硰椥?，也是一個(gè)值得推敲的問題。

在組織工程化血管的培養(yǎng)中還有很多有待解決的問題，如何防止血栓的形成和提高移植物的機(jī)械強(qiáng)度。另外要想達(dá)到接近自體血管的性能，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都需要8周的時(shí)間甚至更長，因?yàn)樾枰凶銐虻臅r(shí)間進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增、細(xì)胞外基質(zhì)的形成和達(dá)到一定的機(jī)械強(qiáng)度。這樣在緊急狀態(tài)下是不可能應(yīng)用組織工程化血管的。而且，必須應(yīng)用自體細(xì)胞來構(gòu)建血管，以避免免疫排斥反應(yīng)。而宿主成體細(xì)胞存在粘附和增殖較弱的問題，還有傳代后細(xì)胞衰老的問題；同時(shí)組織工程化血管的構(gòu)建需要多種技術(shù)的結(jié)合，費(fèi)用昂貴。所有這些都成為血管組織工程發(fā)展的障礙。

盡管存在諸多問題，但已取得的成就還是令人鼓舞的，目前已將干細(xì)胞應(yīng)用到血管組織工程當(dāng)中解決種子細(xì)胞問題，并采用基因工程技術(shù)對種子細(xì)胞進(jìn)行處理；同時(shí)也在進(jìn)行各種新載體材料的開發(fā)研制；生物反應(yīng)器的研究也越來越深入。組織工程化血管最終將成為活的組織，可以生長、塑形，對環(huán)境中的各種生物化學(xué)及物理刺激產(chǎn)生反應(yīng)。這些血管替代物將在結(jié)構(gòu)、成分、機(jī)械性能及功能上非常類似自體血管。隨著對血管發(fā)生及功能中各種因素作用機(jī)制的研究越來越深入，組織工程化血管將最終應(yīng)用到臨床，改善那些有血管疾病患者的生活，對人類的健康做出貢獻(xiàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]汪忠鎬，蒲力群.人工血管生物化-血管內(nèi)皮襯里的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程雜志，1988，7:34-41.

[2]蒲力群，汪忠鎬.犬種植自體血管內(nèi)皮的滌綸人工血管靜脈移植[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，1989，69:519-521.

[3]Williams SK，Jarrell BE，Kleinert LB.Endothelial cell transplantation onto polymeric arteriovenous grafts evaluated using a canine model[J].J Invest Surg，1994，7(6):503-517.

[4]Ladage D，Brixius K，Steingen C，et al.Mesenchymal Stem Cells Induce Endothelial Activation via Paracine Mechanisms.Endothelium[J].2007，14(2):53-63.

[5]Lu A，Sipehia R.Antithrombotic and fibrinolytic system of human endothelial cells seeded on PTFE: the effects of surface modification of PTFE by ammonia plasma treatment and ECM protein coatings[J].Biomaterials，2001，22(11):1439-1446.

[6]Mazzucotelli JP，Moczar M，Zede L，et al.Human vascular endothelial cells on expanded PTFE precoated with an engineered protein adhesion factor[J].Int J Artif Organs，1994，17:112-117.

[7]Deutsch M，Meinhart J，F(xiàn)ischlein T，et al.Clinical autologous in vitro endothelialization of infrainguinal ePTFE grafts in 100 patients:a 9-year experience[J].Surgery，1999，126(5):847-855.

[8]L'Heureux N，Paquet S，Laxoe R，et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel[J].FASEB J，1998，12:47-56.

[9]Wu WC，Kao YH，Chung CH.Effects of growth-factor combinations on vascular endothelial cell growth in vitro[J].J Ocul Pharmacol Ther，2004，20(6):554-562.

[10]Minami T，Horiuchi K，Miura M，et al.Vascular endothelial growth factor- and thrombin-induced termination factor， Down syndrome critical region-1， attenuates endothelial cell proliferation and angiogenesis[J].J Biol Chem，2004 ，279(48):50537-50554.

[11]Kashiwakura Y，Katoh Y，Tamayose K，et al.Isolation of bone marrow stromal cell-derived smooth muscle cells by a human SM22alpha promoter:in vitro differentiation of putative smooth muscle progenitor cells of bone marrow[J].Circulation，2003，107(16):2078-2081.

[12]Matsumura G，Hibino N，Ikada Y，et al.Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience[J].Biomaterials，2003，24:2303-2308.

[13]Shin'oka T.Clinical results of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells[J].Nippon Geka Gakkai Zasshi，2004，105(8):459-463.

[14]Redondo S， Ruiz E， Padilla E，et al.Role of TGF-beta1 in vascular smooth muscle cell apoptosis induced by angiotensin II[J].Eur J Pharmacol，2007，556(1-3):36-44.

[15]Mann BK，Schmedlen RH，West JL，et al.Tethered-TGF-beta increases extracellular matrix production of vascular smooth muscle cells[J].Biomaterials， 2004，22:439-444.

[16]Weinberg CB，Bell E.A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells[J]. Science，1986，231:397-400.

[17]Huynh T，Abraham G，Murray J，et al.Remodeling of an acellular collagen graft into a physiologically responsive neovessel[J].Nat Biotechnol， 1999，17:1083-1086.

[18]Roeder R，Wolfe J，Lianakis N，et al.Compliance，elastic modulus， and burst pressure of small-intestine submucosa(SIS)，small-diameter vascular grafts[J].J Biomed Mater Res，1999，47:65-70.

[19]Opitz F，Schenke-Layland K，Cohnert TU，et al.Tissue engineering of aortic tissue: dire consequence of suboptimal elastic fiber synthesis in vivo[J].Cardiovasc Res，2004，63(4):719-730.

[20]Tsai SH，Liu YW，Tang WC，et al.Characterization of porcine arterial endothelial cells cultured on amniotic membrane， a potential matrix for vascular tissue engineering[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，357(4):984-990.

[21]Teebken OE，Bader A，Steinhoff G，et al.Tissue engineering of vascular grafts: human cell seeding of decellularised porcine matrix[J].Eur J Vasc Endovasc Surg，2000，19(4):381-386.

[22]Schaner PJ，Martin ND，Tulenko TN，et al.Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering[J].J Vasc Surg，2004，40(1):146-153.

[23]Yim EK，Liao IC，Leong KW.Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold:evaluation of blood compatibility and biocompatibility[J].Tissue Eng，2007，13(2):423-433.

[24]Couet F，Rajan N，Mantovani D.Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering[J].Macromol Biosci，2007，7(5):701-718.

[25]Niklason LE，Gao J，Abbott WM，et al.Functional arteries grown in vitro[J].Science，1999，284:489-493.

[26]Shum-Tim D，Stock U，Hrkach J.Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer[J].Ann Thorac Surg，1999，68（6）：2298-2304;discussion 2305.

[27]Aper T，Teebken OE，Steinhoff G，et al.Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model[J].Eur J Vasc Endovasc Surg，2004，28(3):296-302.

[28]Jun HW，West J.Development of a YIGSR-peptide-modified polyurethaneurea to enhance endothelialization[J].JBiomater SciPolymEd，2004，15(1):73-94.

[29]Ratner BD.Surface modification of polymers: chemical， biological and surface analytical challenges[J].BiosensBioelectron，1995，0(9-10):797-804.

[30]Fussell GW，Cooper SL.Synthesis and characterization of acrylic terpolymers with RGD peptides for biomedical applications[J].Biomaterials，2004，25(15):2971-2978.

[31]Fussell GW，Cooper SL.Endothelial cell adhesion on RGD-containing methacrylate terpolymers[J].J Biomed Mater Res A，2004，70A(2):265-273.

[32]Furukawa KS， Ushida T， Toita K， et al.Hybrid of gel-cultured smooth muscle cells with PLLA sponge as a scaffold towards blood vessel regeneration[J].Cell Transplant，2002，11(5):475-480.

[33]Iwai S，Sawa Y，Ichikawa H，et al.Biodegradable polymer with collagen microsponge serves as a newbioengineered cardiovascular prosthesis[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2004，128(3):472-479.

[34]Kim BS，Putnam AJ，Kulik TJ，et al.Optimizing seeding and culture methods to engineer smooth muscle tissue on biodegradable polymer matrices [J]. Biotechnol Bioeng，1998，57(1):46-54.

[35]Conklin BS， Surowiec SM， Lin PH，et al.A simple physiologic pulsatile perfusion system for the study of intact vascular tissue[J]. Med Eng Phys，2000，22:441-449.

[36]Williams C，Wick TM.Perfusion bioreactor for small diameter tissue-engineered arteries. Tissue Eng，2004，10(5-6):930-941.

[37]Williams C，Wick TM.Endothelial cell-smooth muscle cell co-culture in a perfusion bioreactor system[J].Ann Biomed Eng，2005，33(7):920-928.

[38]Hoerstrup SP，Zund G，Sodian R，et al.Tissue engineering of small caliber vascular grafts[J]. Eur J Cardiothorac Surg，2001，20(1):164-169.

[39]Boccafoschi F，Rajan N，Habermehl J，et al.Preparation and characterization of a scaffold for vascular tissue engineering by direct-assembling of collagen and cells in a cylindrical geometry[J].Macromol Biosci，2007，7(5):719-726.

[40]Chue WL，Campbell GR，Caplice N，et al.Dog peritoneal and pleural cavities as bioreactors to grow autologousvascular grafts[J].J Vasc Surg，2004，39(4):859-867.

[收稿日期]2007-06-06 [修回日期]2007-08-15

編輯/李陽利

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”