強脈沖光對成纖維細胞增殖與周期的影響

[摘要]目的：研究強脈沖光對正常離體人皮膚成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）的生長活力、細胞增殖能力以及細胞周期變化的影響并探討其可能的發(fā)生機制，為強脈沖光除皺提供可能的理論依據(jù)。方法：培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，應用MTT比色法、免疫組織化學的方法和流式細胞儀（FCN）分析技術(shù)，觀察皮膚成纖維細胞經(jīng)不同能量的強脈沖光照射后細胞的生長活力、細胞增殖能力以及細胞周期變化。結(jié)果：強脈沖光能促進體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞增殖，F(xiàn)CN結(jié)果顯示強脈沖光照射后，成纖維細胞G1期百分比降低，而S期百分比升高，增殖指數(shù)PrI值（S+G2M）百分比增高。結(jié)論：強脈沖光可促進正常成纖維細胞增殖和DNA合成，從而為強脈沖光面部美容除皺供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]強脈沖光；成纖維細胞；細胞增殖； 細胞周期； 面部除皺

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1331-03

The effects of intense pulse light（IPL） on the cell proliferation activity and cell cycle of human fibroblasts

LI Xiao-ge，LI Shi-rong，CAO Chuan，DENG Xiang-dong

(Department of Plastic Surgery，Southwest Hospital of the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of intense pulse light on the cell proliferation and cell cycle of human fibroblasts and to provide the possible theoritical basis for the treatment of face-lift.MethodsCultured human skin fibroblasts and treated with different dose of intense pulse light radiation.By culturing 24 hours analyzed cell cycle with flow cytometr（FCM）， the cell proliferation activity was measured by MTT assay.ResulstsResults showed both proportion of cells in S and G2M phase was increased and that of G1 was decreased when the cells were irradiate with IPL in comparison with non- irradiate significantly， PrI were beyond its normal range.ConclusionIntense pulse light radiation could promote the cell proliferation and synthesis of DNA in cultured primary fibroblasts.

Key words: intense pulse light; fibroblast ;PCNA; cell cycle; face-lift

皮膚衰老是人體老化的外部表現(xiàn)，其中成纖維細胞在皮膚衰老過程中扮演著重要角色，在皮膚老化時成纖維細胞的生長活力降低，甚至出現(xiàn)明顯的生長間隙阻滯，G2M期細胞數(shù)增加。本實驗通過研究強脈沖光對體外培養(yǎng)的成纖維細胞增殖能力、細胞周期變化以及細胞增殖核抗原的影響，為強脈沖光在面部老化治療中的應用提供理論依據(jù)。

1資料和方法

1.1 標本、試劑及所用儀器:標本選擇泌尿外科身體健康的中青年的包皮手術(shù)時切除的包皮。實驗地點為解放軍第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院。細胞培養(yǎng)、實驗指標檢測均于環(huán)境設施為清潔級、室溫20℃～25℃、相對濕度為60％～70％條件下進行。光子嫩膚儀（GP666－B，深圳市金威源科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（hyclon，美國），新生小牛血清（GibDD，美國），分組：正常對照組采用的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含 10ml／L小牛血清，HEPES 24g／L，碳酸氫鈉15g／L青霉素 100U／ml，鏈霉素 100U／ml。

設計、實施、評估者：研究設計者為第一作者，干預實施者為全部作者，資料收集者為第一作者。

1.2 實驗方法

1.2.1 人成纖維細胞的培養(yǎng)：包皮手術(shù)時按無菌原則留取切除下來的包皮組織，按胰酶消化法實施FB原代培養(yǎng)[1]：無菌條件下去除表皮及皮下脂肪及結(jié)締組織，將漂洗、修剪干凈的組織剪成1～2mm3的小塊。將組織塊放入三角瓶中加入30～50倍0.25%胰酶，封閉燒瓶。將燒瓶放到37℃，并在振蕩儀中振蕩消化1.5h～2h，收集消化液并離心（1 000r/ min，8min），去除上清，用PBS液離心漂洗1～2次，去除上清，加培養(yǎng)液制成細胞懸液，然后進行細胞記數(shù)，接種培養(yǎng)瓶。三四天換液 1次，兩三周后，原代細胞生長成單層，用 25g／L胰蛋白酶消化，按 1／3的比例傳代培養(yǎng)，此后每兩三天換液1次，每四五天傳代1次。本實驗中采用第4～6代細胞。

1.2.2 MTT方法檢測細胞生長活性

1.2.2.1實驗分組：實驗設空白對照(與實驗孔平行，不加細胞只加培養(yǎng)液)、陰性對照（未照射組）及照射組（用5種不同能量的強脈沖光進行照射）

1.2.2.2 強脈沖光光學參數(shù)：波長范圍：400nm～1200nm；光斑面積為22mm×48mm；脈沖寬度：10ms～30ms；從1檔至5檔分別為，能量分別是9J、12J、16J、19J、27J，每個部位平均三個脈沖。

1.2.2.3 MTT比色：實驗原理[1]：四唑鹽比色實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。實驗所用的顯色劑四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，化學名3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍，簡稱為MTT。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶(formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度，可間接反映細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量和細胞數(shù)量成正比。它的特點是靈敏度高、重復性好、操作簡便、經(jīng)濟、快速、易自動化、無放射性污染、與其他檢測細胞活力的方法有良好的相關(guān)性。

1.2.2.4 實驗方法：經(jīng)照射的細胞繼續(xù)置于5%CO₂、37℃箱培養(yǎng)，各組均在24h分別取出四孔每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使藍紫色結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸收值（A值），記錄結(jié)果。

1.2.2.5實驗結(jié)果：照射組在經(jīng)過五個不同能量的光照射后，經(jīng)過繼續(xù)培養(yǎng)24h后，MTT檢測細胞活性，結(jié)果表明A值從0.233±0.020～0.459±0.030，較對照組細胞活性均有不同程度提高，并且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)并且與照射能量成正比 (見表1)。

1.2.3 強脈沖光對 FB細胞周期的影響

1.2.3.1流式細胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理：流式細胞儀通常由光學臺、電子控制臺、數(shù)據(jù)儲存處理計算機三大部分組成。其工作原理是，經(jīng)熒光色素染色的細胞或包裹在鞘液里的其他生物微粒，從50～100μl的噴嘴逐個噴出，通過一個聚焦的光源，進而通過各種光敏元件測量這些細胞或微粒所發(fā)出的散射光以及熒光，經(jīng)計算機分析和處理可得到多種信息參數(shù)。

1.2.3.2實驗方法：取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，進行離心（1 000r/min，8min），調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，接種于6個50ml培養(yǎng)瓶，待細胞亞融合狀態(tài)時照射組進行照射，置于5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

①制備樣本：胰酶消化法分散細胞制成單個細胞懸液備用，將單個細胞懸液離心棄上清，重新懸浮于5ml 4℃預冷的PBS中，緩慢加入-20℃預冷的95%乙醇15ml，使其終濃度為70%，置于4℃冰箱過夜。

② 樣品染色和檢測：離心棄去無水乙醇，用PBS洗滌2次，PBS將細胞濃度調(diào)整為5×104～1×105/ml，加入PI300μl，室溫下染色30min，400目篩網(wǎng)過濾除去成團細胞，在ELITE-ESP流式細胞儀上測定細胞周期。檢測結(jié)果用Multicycle軟件進行各時期細胞數(shù)百分比率分析。

1.2.3.4實驗結(jié)果：亞融合狀態(tài)的成纖維細胞經(jīng)過強脈沖光照射后，繼續(xù)孵育24h后，對細胞周期各時期進行比較，結(jié)果顯示：強脈沖光照射組細胞數(shù)明顯高于對照組， S期和G2M期細胞比數(shù)明顯高于對照組，G1期細胞比數(shù)明顯低于對照組，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

1.2.4強脈沖光對成纖維細胞 PCNA表達的影響

1.2.4.1 實驗原理：免疫細胞化學染色是把血清學方法和顯微示蹤方法結(jié)合起來的一類技術(shù)。根據(jù)標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。它們不僅具有較高的抗原抗體反應的特異性和靈敏性，而且能對組織細胞的成分準確定位及定量分析，因而在基礎醫(yī)學研究和臨床疾病診斷中得到廣泛應用。本實驗所用的染色方法是ABC免疫酶染色法。其原理是特異性第一抗體與組織細胞相應抗原結(jié)合后，通過生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助親和素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過氧化物酶連接為復合物，通過酶促反應顯示組織細胞相應的抗原。

1.2.4.2 實驗方法：將無菌的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板，每孔加入5×107/L的FB 3ml，CO₂孵箱過夜，細胞貼壁后，用5中不同能量的IPL對實驗組進行照射，每孔光斑數(shù)為3個，然后繼續(xù)放入CO₂孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，迅速風干，丙酮固定 20min。 SABC法免疫組化染色，DAB顯色，陽性為細胞核著棕色。在高倍視野下（×400）計細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)，計算PCNA陽性細胞率。

1.2.4.3實驗結(jié)果：強脈沖光對FB PCNA染色的影響：照射組在經(jīng)過五個不同能量的光照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用免疫組織化學方法檢測成纖維細胞PCNA表達的陽性率，結(jié)果表明照光組的成纖維細胞PCNA的表達率較對照組有明顯提高(P<0.05)。見表3。

2討論

強脈沖光(intense pulsed light，IPL)是一種連續(xù)性多波長的非相干性光，波長范圍為500nm～1 200nm。具有能量高、波段相對集中、脈寬可調(diào)等優(yōu)點，與激光極為相似。其優(yōu)點在于可同時治療皮膚多種瑕疵和光老化；具有無疼痛、無剝脫、無需休息的優(yōu)點。其生物學效應的主要作用機理是強脈沖光作用于皮膚產(chǎn)生的光熱作用及光化學作用[2]，它不破壞表皮層，是將廣譜的強脈沖光輻射至皮膚真皮層，引起真皮原有膠原蛋白變性，促使真皮層新膠原蛋白的合成，改善多種皮膚瑕疵，如毛細血管擴張、細小皺紋、皮膚紅斑、色素沉著和毛孔粗大等[3]，從而達到增強皮膚彈性，改善面部皮膚狀況等醫(yī)療美容效果，同時因其獨特的優(yōu)勢在醫(yī)療美容界倍受關(guān)注，并在臨床取得了良好的效果，但對其嫩膚機制尚不明確。本文從細胞水平，對強脈沖光嫩膚的機制進行探討。

成纖維細胞的活性功能包括增殖分化功能和細胞外基質(zhì)的合成和分泌功能。在皮膚老化時成纖維細胞的生長活力降低，增殖能力逐漸下降，細胞周期延長，甚至出現(xiàn)明顯的生長間隙阻滯，其標志之一就是細胞周期不可逆的停滯在G1期，用流式細胞儀進行細胞計數(shù)是一種比較準確的細胞計數(shù)方法，并能檢測出細胞周期的變化，以及各期所占的比例，從而了解DNA的合成情況。本實驗以成纖維細胞為研究對象，用常規(guī)MTT檢測方法檢測了成纖維細胞在強脈沖光照射24h后的細胞活性，并在光鏡下觀察了細胞形態(tài)的變化，結(jié)果表明經(jīng)過強脈沖光照射24h后成纖維細胞的形態(tài)沒有明顯變化，但其活性較對照組增強。

細胞的增殖周期由DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)組成。此外，暫時脫離細胞周期不進行增殖的細胞稱為G0期細胞。通過對細胞周期的檢測，其結(jié)果表明經(jīng)過強脈沖光照射24h后成纖維細胞周期各時相DNA含量均較對照組發(fā)生變化，其中S期和G2M期細胞比數(shù)明顯高于對照組，G1期細胞比數(shù)明顯低于對照組。增殖指數(shù)[4-5]( proliferation index，PrI)代表了該細胞群體中增殖期細胞的數(shù)量，以(S－G2M)％表示，其中 G2為 DNA合成后期，M期為有絲分裂期，它在一定程度上可反映細胞的增殖狀態(tài)。強脈沖光照射后Prl升高，其可能的作用機制是激活靜止態(tài)的G1期細胞向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，從而促進細胞的增殖。

細胞增殖核抗原PCNA是細胞由G0/G1期進入S期(DNA合成期)必不可少的一種蛋白質(zhì)[6]。PCNA又稱周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提純。研究表明PCNA本質(zhì)是一種DNA聚合酶的附屬蛋白[7]，與細胞增殖有關(guān)。在靜止細胞中，其量很少，G1晚期開始增加，S期達到高峰，G2M期明顯下降[8]。目前PCNA已成為了解細胞增殖活性狀態(tài)的重要指標。我們的實驗結(jié)果表明經(jīng)過強脈沖光照射后細胞增殖核抗原PCNA表達率明顯增加，這和細胞增殖能力增加進入增殖狀態(tài)的細胞數(shù)增加是一致的。

強脈沖光上調(diào)成纖維細胞的PCNA的表達水平，增強細胞增殖活性，推測可能有以下兩種途徑：①強脈沖光作用于成纖維細胞可通過某些因子，直接增加PCNA蛋白的表達，從而增加DNA聚合酶的活性，增加在S期成纖維細胞的DNA合成，從而促進細胞增殖；②強脈沖光促進成纖維細胞靜止態(tài)的G1期細胞向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，成纖維細胞增殖活性增強，針對這種可能的作用機制，還有待進一步深入研究。

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[收稿日期]2007-02-05 [修回日期]2007-09-18

編輯/張惠娟