血管抑制基因治療對增生性瘢痕的病理學影響

[摘要]目的：研究血管抑制基因治療對兔耳增生性瘢痕的病理學影響。方法：復(fù)制兔耳增生性瘢痕，待創(chuàng)面上皮化后10天瘢痕組織局部多點注射基因重組血管抑制劑Ad-METH1（血管生成抑制因子-1，extracellular protein with metalloprotease and thrombospondin1 domains），30天后觀察兔耳瘢痕組織形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：Ad-METH1注射后30天，兔耳瘢痕組織學染色顯示微血管分布明顯減少，超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)皮細胞腫脹、變性，部分血管喪失功能，成纖維細胞增殖及分泌活性明顯降低。結(jié)論：Ad-METH1對增生性瘢痕的形成有明確的抑制作用，血管抑制基因治療有望為增生性瘢痕的防治提供新的方法。

[關(guān)鍵詞]基因治療；血管抑制；增生性瘢痕；超微結(jié)構(gòu)

[中圖分類號]R619.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1334-03

The pathological influence of antiangiogenesis gene therapy on hypertrophic scar

ZHANG Hua-bin1，SONG Bao-qiang2，LU Kai-hua2，CHEN Ji-yang1，HUANG Xiao-feng3，YU Hua3，MA Fu-cheng4，SUN Dong-yuan1

(1.Department of Plastic and Burn Surgery， Shekou People's Hospital， Shenzhen 518067，Guangdong，China; 2. Department of Plastic Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University， Xi'an 710032，Shaanxi，China; 3.The Center of Electron Microscope，Department of Fundament， the Fourth Military Medical University; 4.Department of Pathology， Xijing Hospital， the Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo investigate the pathological influence of antiangiogenesis gene therapy on hypertrophic scar of rabbits' ears.Methods The hypertrophic scar of rabbits' ears was reproduced. At the 10th day after epithelization on the surface of wound， Ad-METH1 was injected into parts of scar tissue on different points. 30 days later， changes of structure and ultrastructure of scar tissue of rabbits' ears were observed.ResultsAt the 30th days after injection， HE deying of the hypertrophic scar of rabbits' ears showed that the distribution of micrangium declined distinctly. Ultrastructure revealed that endotheliocytes were tumefied and destructured， some blood vessels lost functions and proliferation and secretion of fibroblast reduced markedly.Conclusion Ad-METH1 has marked inhibitory function on the form of hypertrophic scar. Antiangiogenesis gene therapy could provide a new method to prevent and cure hypertrophic scar.

Key words: gene therapy; antiangiogenesis; hypertrophic scar; ultrastructure

眾多的臨床觀察及實驗研究顯示，血管及其相關(guān)因子的表達與增生性瘢痕的形成有著密切的關(guān)系，通過血管生成抑制或其相關(guān)促成因子的拮抗治療，可有效抑制瘢痕增生[1-2]。隨著基因技術(shù)研究的不斷深入，基因治療在增生性瘢痕防治研究領(lǐng)域也取得了一定的進展。本研究擬利用攜帶高效血管抑制因子METH1的腺病毒表達載體pAdEasy-meth1，轉(zhuǎn)染兔耳增生性瘢痕[3]，研究血管抑制基因治療對兔耳增生性瘢痕組織形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)的影響。

1材料和方法

1.1 實驗分組及模型復(fù)制：選日本大耳白兔l0只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg/只，人工混合飼料喂養(yǎng)。隨機將每只兔子的一只耳歸入實驗組，另一只耳歸入對照組，每組各l0只。實驗組與對照組均進行模型復(fù)制[4]，速眠新1ml／kg，兔耳緣靜脈注射麻醉后，常規(guī)消毒鋪單，于兔耳腹側(cè)面用打孔器復(fù)制6個直徑約1cm的圓形創(chuàng)面，去除皮膚全層，保留軟骨，待其自然愈合。

1.2 基因轉(zhuǎn)染：待兔耳創(chuàng)面上皮化后10天實施。① 實驗組行兔耳瘢痕局部多點注射pAdEasy-meth1重組腺病毒質(zhì)粒；②對照組注射等量空腺病毒。

1.3 指標觀察：30天后觀察兩組瘢痕形態(tài)外觀、組織結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)的差異，分析基因轉(zhuǎn)染血管抑制治療對兔耳增生性瘢痕的影響。

1.3.1 外觀形態(tài)：觀察對比實驗組與對照組瘢痕組織顏色、質(zhì)地、厚度的差異。

1.3.2 組織形態(tài)：分別切取實驗組與對照組瘢痕，取材部位位于瘢痕組織中央與周邊交界區(qū)，隨即將其固定于Bouin氏液12h后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成厚度約5μm的石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，200×光鏡下對比分析兩組瘢痕組織學差異。

1.3.3 超微結(jié)構(gòu)：取材部位同前，將標本切割為大小為1mm×3mm組織塊，用4℃預(yù)冷的3%戊二醛固定24h，1%鋨酸固定，系列乙醇－丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，常規(guī)制作切片，電子染色，在透射電鏡下采用不同放大倍數(shù)對瘢痕組織超微結(jié)構(gòu)進行觀察。

2結(jié)果

2.1 外觀形態(tài)：實驗組pAdEasy-meth1注射后30天，瘢痕顏色接近正常兔耳膚色，表面平整，質(zhì)地接近正常。對照組瘢痕明顯高出兔耳腹側(cè)皮面，呈淡紅色，質(zhì)地堅硬。兩組瘢痕形態(tài)外觀有顯著差異。

2.2 組織形態(tài)：pAdEasy-meth1注射后30天，實驗組瘢痕微血管分布明顯減少，成纖維細胞散在，膠原排列有序。對照組瘢痕組織中見大量成纖維細胞，血管分布豐富，淺層組織膠原纖維粗大、排列紊亂。實驗組與對照組組織學存在顯著性差異。

2.3 超微結(jié)構(gòu)：pAdEasy-meth1注射后30天，瘢痕組織成纖維細胞核仁不明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)不清，血管腔狹窄、內(nèi)皮細胞腫脹，空泡化明顯，胞質(zhì)密度低，微絨毛消失(圖1、2)。對照組成纖維細胞核仁明顯，胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，線粒體豐富，蛋白分泌物較多，瘢痕組織毛細血管基膜完整，血管周圍可見扁平狀周皮細胞（圖3、4）。

3討論

增生性瘢痕是整形外科的常見病癥，由于發(fā)生機理尚不十分清楚，目前除手術(shù)外尚無非常有效的防治手段，研究增生性瘢痕的發(fā)生機理，探索行之有效的非手術(shù)防治方法有著重要的意義。

越來越多的研究顯示，血管生成與增生性瘢痕的形成有著密切的關(guān)系[5，8，9]。在皮膚軟組織創(chuàng)傷后所經(jīng)歷的炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、組織重塑、瘢痕形成等階段中，血管及其相關(guān)生物活性物質(zhì)發(fā)揮了重要作用，其中TGF-β、VEGF、FGF和IGF等生長因子參與并調(diào)控了創(chuàng)傷修復(fù)的過程[6-7]，影響著傷口的愈合及增生性瘢痕的形成。研究還顯示，處于增生期的瘢痕組織血管密度高于成熟期瘢痕[5，8]，通過激光多普勒對瘢痕組織微循環(huán)檢測顯示，增生期瘢痕組織微循環(huán)灌注高于成熟期[9-10]，通過對瘢痕組織血管的抑制可促進瘢痕的軟化[1-2]，提示血管生成抑制方式防治增生性瘢痕的可行性。

本研究中，我們選用了一種新型的血管抑制劑METH-1作用于兔耳增生性瘢痕，研究血管抑制治療對增生性瘢痕的影響。METH-1是TSP-1的結(jié)構(gòu)類似物， TSP-1是生理條件下最主要的血管生成抑制因子，可以抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[11]，TSP-1由于分子量大，不易制備，易被蛋白酶降解等特點，其應(yīng)用受到了一定的限制。體內(nèi)、外實驗表明，METH1可通過對內(nèi)皮細胞的直接作用抑制血管生成過程，其作用比TSP-1強15～20倍[11-12]。我們利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶METH1的腺病毒載體pAdEasy-meth1，并在293細胞中完成病毒的重組、包裝[3]。我們將該載體轉(zhuǎn)染增生性瘢痕動物模型，研究了基因轉(zhuǎn)染血管抑制對增生性瘢痕的影響。

結(jié)果顯示pAdEasy-meth1注射后30天，與對照組相比，兔耳瘢痕增生受到明顯抑制，組織學染色顯示實驗組瘢痕血管減少，成纖維細胞及膠原分布為成熟期表現(xiàn)，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞增殖及分泌活性差，血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹、變性，部分血管喪失功能，提示 pAdEasy-meth1對瘢痕組織血管生成、組織增生抑制的有效性。

METH1作為血管抑制劑通過抑制血管生成抑制的方式抑制增生性瘢痕的形成，考慮與其對瘢痕組織中血管及其相關(guān)因子的抑制有關(guān)，該結(jié)果證實了METH1抑制增生性瘢痕的可行性，有望為增生性瘢痕的防治研究提供新的方法。

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[收稿日期]2007-05-25 [修回日期]2007-08-23

編輯/張惠娟