周期性牽張應(yīng)力對(duì)人成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜影響的初步研究

[摘要]目的：研究周期性牽張力對(duì)人成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，為進(jìn)一步研究機(jī)械應(yīng)力狀態(tài)下骨改建機(jī)理提供思路和線索。方法：通過體外細(xì)胞加載系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞施加8％形變率、6周/min的周期性牽張力24 h，應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)人成骨細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比雜交分析，檢測(cè)周期性牽張力加載組成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果：在所分析的21 073條人類功能基因中，加載組與未加載組人成骨細(xì)胞之間差異表達(dá)顯著的基因有2 498條，其中表達(dá)上調(diào)的有899條(2.0倍以上)，表達(dá)下降的有1 599條(0.5倍以下)。這些基因表達(dá)產(chǎn)物涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多個(gè)方面。結(jié)論：周期性牽張力對(duì)成骨細(xì)胞多種基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，成骨細(xì)胞的應(yīng)力反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的，多基因參與調(diào)控的過程。這些變化的基因可能與成骨細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]周期性牽張應(yīng)力；人成骨細(xì)胞；基因表達(dá)譜；基因芯片

[中圖分類號(hào)]R783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2007）10-1410-03

Experimental study of effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts

QIU Jun，LI Yong-ming，LIN Zhu，CHEN Qiao-ling

(Department of Orthodontics，College ofStomatology，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo study effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts in vitro.MethodsHuman osteoblasts were cultured on flexible-bottomed plates and subjected to 8% elongation by strain unit at 6 cycles/min (i.e.5-s elongation and 5-s relaxation) for 24 hours in the experimental groups. Control group were not exerted any strain. Both of them were examined by gene expression profiles chip technology. Results A series of differentially expressed genes were found between experimental group and control group. 899 up-regulated and 1599 down-regulated genes were identified among the 2 498 differentially expressed genes.ConclusionThe results shows that the response ofhuman osteoblasts to cyclic tensile strain in gene level was complicate. These differentially expressed genes are necessary genes related to osteoblasts response to mechanical strain.

Key words:cyclic tensile strain；human osteoblast；gene expression profile； gene chip

成骨細(xì)胞(Osteoblast)是一種對(duì)應(yīng)力敏感的細(xì)胞，來(lái)自多潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)形成及鈣化，在骨改建過程中起重要作用。大量研究表明[1-5]：成骨細(xì)胞在應(yīng)力狀態(tài)下，細(xì)胞活力、新陳代謝以及與細(xì)胞成骨有關(guān)的骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth receptor，EGFR)、細(xì)胞外基質(zhì)等發(fā)生變化。但是以往的研究多限于一個(gè)或幾個(gè)分子基因，難以全面系統(tǒng)地了解成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激的反應(yīng)模式。因此，本研究利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，比較全面地分析牽張應(yīng)力條件下人成骨細(xì)胞功能活性的影響因素，研究周期性牽張力對(duì)人成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，為進(jìn)一步研究機(jī)械應(yīng)力狀態(tài)下骨改建機(jī)理提供思路和線索。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；TRIZOL 試劑(Invitrogen，美國(guó))；Agilent 人1A基因表達(dá)譜芯片（Agilent，美國(guó)）；cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒（Lifegen，美國(guó)）；芯片雜交試劑盒（Agilent，美國(guó)）；RNA純化試劑盒(Qiage，美國(guó)）；芯片掃描儀（Axon 400B，美國(guó)）；Genepix3.0軟件(General Scanning，美國(guó))；多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載儀（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院）；6孔彈性膜培養(yǎng)板(Flexcell，美國(guó))。

1.2 人成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：經(jīng)患者及其家長(zhǎng)同意，取一名14歲女性兒童因正畸需要撥除下頜第三磨牙牙胚時(shí)去除牙槽骨塊約0.5～1.0g，將組織放于盛少量小牛血清的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎成約1mm3大小。按酶消化法原代培養(yǎng)人成骨細(xì)胞，通過活體觀察、堿性磷酸酶(ALP)染色、骨鈣素免疫組織化學(xué)染色法鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞，取第5～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 加載周期性牽張力：將第5代成骨細(xì)胞按1.5×105／孔接種到兩塊6孔彈性膜培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24h，細(xì)胞在彈性膜底貼壁牢固，生長(zhǎng)至約80%底壁面積，換含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置24h，再次換含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。其中一塊6孔彈性膜培養(yǎng)板作為實(shí)驗(yàn)組，應(yīng)用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載儀對(duì)培養(yǎng)在彈性膜培養(yǎng)板上的成骨細(xì)胞施加6周/min、8%形變率的周期性牽張力24h后收集細(xì)胞。另一塊6孔彈性膜培養(yǎng)板作為對(duì)照組不加載機(jī)械力，在相同條件下培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.4基因表達(dá)譜芯片分析分別取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組人成骨細(xì)胞，加適量TRLzol勻漿，離心10min。取上清液加入氯仿，震蕩后放置3min，向上清液中加異丙醇充分混勻再離心10min。加入兩次75%乙醇離心棄上清，加入RNAse-free超純水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。經(jīng)預(yù)雜交后加入逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA ，以Cy5標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞cDNA，Cy3標(biāo)記對(duì)照組細(xì)胞cDNA做探針，純化后在Agilent Human 1A基因表達(dá)譜芯片上進(jìn)行雜交。沖洗玻片晾干后以Axon 400B掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖像，用基因圖像分析軟件Genepix3.0對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)字化處理和分析。判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為：①Cy3和Cy5信號(hào)比值的自然對(duì)數(shù)的絕對(duì)值(Ratio)>0.69(基因的表達(dá)變化在2倍以上)；②Cy3和Cy5信號(hào)值其中之一必須大于800。

2結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果：人成骨細(xì)胞總RNA凝膠電泳可見mRNA 18S、28S條帶清晰（如圖1）。紫外分光檢測(cè)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組人成骨細(xì)胞總RNAOD260/OD280>1.9，說明提取RNA的純度和完整性達(dá)到要求。

2.3 基因芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖（如圖3）：分別以參加比對(duì)兩組數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值（Ln）作為橫縱坐標(biāo)作圖，以散點(diǎn)分布趨勢(shì)直觀判斷兩組數(shù)據(jù)的差異狀況，沿45°對(duì)角線方向分布的基因，表示它在兩樣本中的表達(dá)量是相同的。距離對(duì)角線垂直距離越遠(yuǎn)的基因，表示它在某一樣本中的差異表達(dá)程越大。設(shè)R=S/ C（S代表縱坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù)，C代表橫坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù)），其中紅色的點(diǎn)代表R≥2，即S相對(duì)C表達(dá)上調(diào)大于2倍的基因，綠色的點(diǎn)代表R≤0.5，即S相對(duì)C表達(dá)下調(diào)小于0.5倍的基因，藍(lán)色的點(diǎn)表示0.5

1.4 基因表達(dá)譜分析結(jié)果：在所分析的21 073條人類功能基因中，加載組與未加載組人成骨細(xì)胞之間差異表達(dá)顯著的基因有2 498條，其中表達(dá)上調(diào)的有899條(2.0倍以上)，表達(dá)下降的有1 599條(0.5倍以下)。按其功能可分為：細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白類基因；離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍?；?xì)胞周期相關(guān)基因；DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄起始因子；代謝相關(guān)的酶和激酶基因；免疫球蛋白基因；細(xì)胞受體類基因；DNA合成、修復(fù)和重組蛋白類基因；細(xì)胞骨架蛋白；其它基因。

3討論

應(yīng)力作為細(xì)胞分子調(diào)控的一種刺激因子，是影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要的外界信息。骨組織為獲得適應(yīng)現(xiàn)存應(yīng)力環(huán)境的理想結(jié)構(gòu)，在人的一生中不斷改建重塑。通過成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)力環(huán)境的感受，進(jìn)行骨基質(zhì)的有序合成和降解，從而維持骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。近10年來(lái)，雖然有關(guān)牽張應(yīng)力條件下，體外成骨細(xì)胞生物學(xué)特性變化方面的研究很多，但牽張應(yīng)力導(dǎo)致成骨細(xì)胞生物學(xué)行為變化的分子機(jī)制尚不清楚。由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，機(jī)械應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響是通過多因子多通路的相互作用來(lái)控制的，傳統(tǒng)的研究方式難以全面系統(tǒng)地了解成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激的反應(yīng)模式。

基因表達(dá)譜芯片技術(shù)是集分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)、計(jì)算機(jī)檢測(cè)與分析等多種高新技術(shù)為一體的研究手段。其基本原理是通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫(kù)，收集cDNA 序列片段，分析其mRNA群體組成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)種類和豐度信息的描繪?；虮磉_(dá)譜從mRNA 水平反映了細(xì)胞或組織的特異性表型和表達(dá)模式。和其它的基因芯片相比，基因表達(dá)譜芯片的反應(yīng)原理仍然是核酸雜交，所不同的是樣品標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)?；虮磉_(dá)譜芯片通過雙色熒光標(biāo)記，將來(lái)源于不同細(xì)胞或組織的mRNA在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中分別用不同顏色的熒光標(biāo)記成探針，等量混合后與芯片上的基因進(jìn)行雜交反應(yīng)，用特有的熒光波長(zhǎng)掃描結(jié)果芯片，并將掃描所得信號(hào)值輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，給出每個(gè)點(diǎn)在不同波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度值及其比值(Ratio 值)，這些信號(hào)就代表了樣品中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。目前常用的熒光染料是Cy3(綠色)和Cy5(紅色)。如果用Cy3 標(biāo)記樣本1 mRNA，Cy5 標(biāo)記樣本2 mRNA，反應(yīng)后那些在樣本2中呈高表達(dá)(或只在樣本2中表達(dá)) 的基因其雜交點(diǎn)就會(huì)呈現(xiàn)紅色，相反，那些在樣本1中高表達(dá)(或只在樣本1中表達(dá)) 的基因其雜交點(diǎn)就會(huì)呈現(xiàn)綠色， 在兩樣本中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)娘@黃色， 而均不表達(dá)的則為無(wú)色[6-7]。本研究所選Agilent人1A基因表達(dá)譜芯片屬于寡核苷酸芯片類型，共包括22 575個(gè)樣點(diǎn)，其中覆蓋人類基因21 073個(gè)，該基因芯片產(chǎn)品的寡核苷酸探針序列均來(lái)自國(guó)際公認(rèn)的Incyte、RefSeq和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

本研究通過對(duì)周期性牽張應(yīng)力加載前后人成骨細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)2倍以上的基因有899種，按基因大致功能歸屬分，它們是7種細(xì)胞因子、113種酶、21種G蛋白偶聯(lián)受體、8種生長(zhǎng)因子、15種離子通道、25種激酶、4種依賴配體細(xì)胞核受體、16種肽酶、9種磷酸酶、76種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因、18種跨膜受體、45種運(yùn)載體、其它的542種。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)0.5倍以下的基因有1599種，它們是5種細(xì)胞因子、245種酶、8種G蛋白偶聯(lián)受體、4種生長(zhǎng)因子、6種離子通道、66種激酶、3種依賴配體細(xì)胞核受體、47種肽酶、28種磷酸酶、170種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因、7種跨膜受體、92種運(yùn)載體、其它的918種。在這些發(fā)生變化的基因中，包括以往研究較多作用相對(duì)清楚的基因，如同源異形盒基因MSX1(Muscle segment homeobox gene)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、骨形成蛋白-2、表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor，IGF)、某些細(xì)胞外基質(zhì)和相關(guān)蛋白及一些細(xì)胞粘附分子等基因[8-9]，但大部分參與成骨細(xì)胞應(yīng)力反應(yīng)的基因的作用和功能并不清楚。

由此可見，機(jī)械應(yīng)力狀態(tài)下人成骨細(xì)胞的應(yīng)力反應(yīng)調(diào)控過程是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，本研究將為進(jìn)一步研究機(jī)械應(yīng)力狀態(tài)下骨改建機(jī)理提供思路和線索。

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[收稿日期]2007-08-14 [修回日期]2007-09-18

編輯/何志斌