重組人ＶＥＧＦ基因?qū)τ坞x組織移植物血管形成的作用

[摘要]目的：研究重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因?qū)τ坞x皮瓣、皮片及游離顆粒脂肪等移植物血管形成的作用。方法：將帶有PCD-VEGF165的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，通過(guò)堿分裂法制備PCD-VEGF165質(zhì)粒，再用反蒸發(fā)法將質(zhì)粒包埋于脂質(zhì)體中。將108只雄性SD大鼠均分為三組，每組36只，每組再分三小組，分別為PCD-VEGF165目的基因組、PCD空白質(zhì)粒組和生理鹽水組，注入后在不同時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本做成石蠟塊行常規(guī)染色以觀察血管生長(zhǎng)情況。結(jié)果:三種移植組織中目的基因組微血管密度均顯著高于其他兩對(duì)照組（P<0.01），血管直徑明顯小于對(duì)照組（P<0.05），空白質(zhì)粒組及生理鹽水組差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05）。結(jié)論：VEGF基因生物活性穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。注射轉(zhuǎn)VEGF基因的質(zhì)粒后可誘導(dǎo)移植組織周圍新血管的形成，增加血流灌注。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)；血管形成；皮瓣；皮片；游離顆粒脂肪

[中圖分類號(hào)]R813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2007）10-1325-03

Experimental study on the angiogenesis of rhVEGF gene to free transplanted tissue

LIU Jia-feng，ZHONG Wen-hui，ZHANG Yi-ming，YI Chuan-xun，ZHANG Jun，LIU Yu-lan，NIE Zhu-feng

（Department of Plastic Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong Science Technological University，Wuhan 430022，Hubei，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the angiogenesis of rhVEGF in the free transplanted tissues，such as flaps， grafts and free autologous pearl fat grafts in rats.MethodsThe plasmids with PCD-VEGF165 were made by alkalielysis method after the E.coli with PCD-VEGF165 was cultivated in the LB culture medium， and then the plasmid were buried in the liposome by reverse evaporation method. One hundred and eight Sprague-Dawley rats were divided into three groups: the flaps， the grafts andthe free fat. There were thirty six animals in each groups. And then all the groups were divided into three secondary groups: Injected with the plasmid cDNA encoding the 165-amino acid isoform of VEGF as the experiment group， the blank plasmid DNA as the negative control group and the normal saline as the frank control group. After injection the specimens were cut and harvested for pathological test. ResultsThe microvessel count in the PCD-VEGF165 groups were significantly higher than the other two control groups（P<0.01）.And the average vessel diameter of the PCD-VEGF group was finer than the other two control groups（P<0.05）. There were no significant difference in the blank PCD groups and the normal saline groups (P>0.05).ConclusionThe VEGF gene is stable ，special and enduring. And the angiogenesis and blood supply increased after it was injected in the free transplanted tissues.

Key words:vascular endothelial growth factor;angiogenesis;flap;graft;free pearl fat

自體組織移植的成活率一直是整形外科醫(yī)生十分關(guān)注的問(wèn)題之一，而提高成活率需要解決的核心問(wèn)題是移植組織的血供問(wèn)題，對(duì)移植組織的血供影響最大的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），它能選擇性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂[1-3]，在血管發(fā)生和形成中起到重要的調(diào)節(jié)作用[4]。但是VEGF價(jià)格昂貴、在體內(nèi)不穩(wěn)定、半衰期短的特點(diǎn)限制了它在臨床的應(yīng)用。而外源性VEGF基因通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞后具有生物活性穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，表達(dá)的VEGF可以分泌出細(xì)胞而發(fā)揮作用。我們應(yīng)用分子生物學(xué)的方法在構(gòu)建PCD-VEGF165重組質(zhì)粒，并將之直接作用于皮瓣、皮片及游離顆粒脂肪的局部，探討它對(duì)移植組織中血管形成的作用及其機(jī)制。

1材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料：PCD-VEGF165由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I購(gòu)自Gibco公司。鼠抗人VEGF單克隆抗體，生物素標(biāo)記的多克隆抗小鼠IgG抗體及CD34單克隆抗體均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Sprague-Dawley大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 PCD-VEGF165質(zhì)粒的制備：將含有PCD-VEGF165質(zhì)粒的大腸桿菌菌種接種到LB培養(yǎng)基中，通過(guò)堿裂解法大量提取質(zhì)粒。用聚乙二醇純化所提取的質(zhì)粒，紫外線分光光度計(jì)定量，以了解所提取質(zhì)粒的濃度和純度。取少量的質(zhì)粒用BamHI，EcoRI雙酶切鑒定，以檢測(cè)目的基因和載體。用反向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體包埋重組質(zhì)粒，形成PCD-VEGF165脂質(zhì)體復(fù)合物。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)：將108只大鼠平均分成三組，每組36只，分別為：皮片組、皮瓣組和游離脂肪組。每組內(nèi)再分為三小組，每小組12只，分別為： PCD-VEGF165試驗(yàn)組、PCD空白對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組。

1.3.1皮片組：在大鼠背部?jī)蓚?cè)各作一3cm×2cm大小皮片，保留完整的皮下血管網(wǎng)，將含VEGF基因的脂質(zhì)體100μg稀釋成1000μl，10等份，每個(gè)皮片內(nèi)選擇均勻分布的5個(gè)點(diǎn)各注射100μl，受區(qū)皮下分5點(diǎn)各注射100μl，對(duì)照組同樣方法各注射PCD及生理鹽水1000μl，皮片左右交換位置后移植于對(duì)側(cè)，縫合打包固定。術(shù)后24h處死動(dòng)物4只，切取皮膚及皮下組織標(biāo)本做成石蠟塊，術(shù)后7天、14天分別取4只動(dòng)物，處死動(dòng)物切取標(biāo)本，做成石蠟塊。

1.3.2皮瓣組：以腹壁下動(dòng)脈為中軸，設(shè)計(jì)并形成一5cm×2.5cm的皮瓣，將含VEGF基因的脂質(zhì)體100μg稀釋成1000μl，10等份，每個(gè)皮瓣內(nèi)選擇均勻分布的5個(gè)點(diǎn)各注射100μl，受區(qū)皮下分5點(diǎn)各注射100μl，對(duì)照組同樣方法各注射PCD及生理鹽水1000μl，止血，縫合皮膚切口。術(shù)后第4天麻醉后，顯露大鼠腹壁下動(dòng)靜脈并結(jié)扎，縫合切口，術(shù)后12h處死動(dòng)物4只，切取標(biāo)本。術(shù)后7天、14天分別取4只動(dòng)物，處死動(dòng)物切取標(biāo)本，做成石蠟塊。

1.3.3 游離脂肪組：取腹股溝區(qū)脂肪0.2g，均勻剪成20小塊，脂肪用生理鹽水洗兩次，剪碎，將100μg VEGF基因加生理鹽水稀釋成1ml，與剪碎的脂肪均勻混合，注射于皮膚與其下的肌肉之間。對(duì)照組同樣方法以PCD及生理鹽水1ml與脂肪混合注射。動(dòng)物于第3天，第7天和第14天處死并分離出移植物，標(biāo)本用10%福爾馬林固定，常規(guī)制成石蠟切片。

1.4血管染色及計(jì)數(shù)方法：CD34單克隆抗體作為第一抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照免疫組化SP法操作步驟進(jìn)行，DAB顯色后蘇木素復(fù)染。每張切片在×100倍光鏡下定位微血管CD34強(qiáng)烈表達(dá)的區(qū)域，然后于高倍視野（×400）中計(jì)數(shù)微血管數(shù)量，凡是染成棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇集以及分叉的血管均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片常規(guī)取3個(gè)視野，然后求其均值。

2結(jié)果

2.1 PCD-VEGF165重組質(zhì)粒的鑒定：用堿裂法大量提取的質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)聚乙二醇純化后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取質(zhì)粒的純度和濃度，根據(jù)公式：樣品濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000，得出DNA樣品的濃度為：10.5μg/μl，OD260/OD280=1.78，比值介于1.6與1.8之間，說(shuō)明獲取的DNA純度高。PCD-VEGF165經(jīng)BamH I 和EcoR I雙酶切后，在1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，在5.4kb和600kb處出現(xiàn)兩條帶，分別為載體和目的基因。

2.2常規(guī)病理學(xué)檢查結(jié)果分析

2.2.1 皮瓣組：標(biāo)本經(jīng)常規(guī)染色后進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，可見(jiàn)血管主要集中在真皮下，其中目的基因組的血管大部位管壁菲薄，且直徑明顯較對(duì)照組為小（ P<0.01）。目的基因組平均血管數(shù)較對(duì)照組多，且有顯著性差異（P<0.01），如表1所示。

2.2.2皮片組：標(biāo)本經(jīng)常規(guī)染色后，低倍顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組中皮下肉膜及肌肉中毛細(xì)血管密度明顯高于對(duì)照組，且多為管徑較小的新生毛細(xì)血管，目的基因組中血管密度與對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01），而管徑卻明顯小于對(duì)照組（P<0.05），如表2所示。

2.2.3游離脂肪組:標(biāo)本均存在被膜，纖維間隔。其中目的基因組的移植物纖維被膜及間隔較厚，由肉芽組織以及纖維組織所構(gòu)成，新生血管豐富，有些血管呈垂直狀向移植物延伸。脂肪組織結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞分化成熟，空白質(zhì)粒組和生理鹽水組移植物被膜較菲薄，移植物內(nèi)血管分布不均，邊緣密集，中央較疏，鏡下存在大量囊樣脂池，壞死區(qū)。在各個(gè)時(shí)期不論被膜或移植脂肪組織中，目的基因組均較其他兩組的血管密集，直徑小，如表3所示。

3討論

機(jī)體組織的缺損、畸形及創(chuàng)傷的修復(fù)往往需要采用各種類型的組織移植，所以活體組織移植是目前整形外科最常用的治療手段之一，而組織移植成活的關(guān)鍵在于能否在受區(qū)建立穩(wěn)定的血供關(guān)系。血供良好的受區(qū)可以為移植組織提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，保證移植物的成活。所以新生血管的形成是組織移植中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如何促進(jìn)血管的形成是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是迄今為止發(fā)現(xiàn)的促血管再生能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，其中VEGF165在體內(nèi)分布廣泛，表達(dá)水平最高，是體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要形式，它與相應(yīng)的受體結(jié)合后能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，形成血管[5]，已有學(xué)者將之應(yīng)用于治療下肢動(dòng)脈閉塞性缺血及冠心病心肌缺血的治療并取得良好的效果[6]，但是VEGF在體內(nèi)的、不穩(wěn)定且半衰期短的特點(diǎn)限制了它的臨床應(yīng)用，而外源性VEGF基因在載體的作用下進(jìn)入細(xì)胞，具有生物活性穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，因此，我們以VEGF165的cDNA作為目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒PCD- VEGF165，并通過(guò)脂質(zhì)體導(dǎo)入細(xì)胞而發(fā)揮作用。

以往的研究證明通過(guò)基因治療可以促進(jìn)血管生成，保證移植組織血供，促進(jìn)損傷愈合[7]。本實(shí)驗(yàn)中免疫組化染色證明在目的基因組中VEGF的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（另文報(bào)道），說(shuō)明外源性的基因通過(guò)載體的作用進(jìn)入細(xì)胞后可以在局部表達(dá)豐富的外源性細(xì)胞因子，較對(duì)照組的因缺血而導(dǎo)致分泌的內(nèi)源性細(xì)胞因子明顯增多[8]。目的基因組的平均血管數(shù)較對(duì)照組明顯多，而平均血管直徑卻小于對(duì)照組，均存在顯著性差異。表明目的基因組局部高濃度的VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成了較對(duì)照組更為豐富的血管，使缺血的組織血供得以改善，提高組織的成活率，體現(xiàn)在移植的皮瓣及皮片成活率增高，游離脂肪的吸收率減低。至于外源性基因是如何在局部發(fā)揮作用的，可能機(jī)制有：①VEGF目的基因的上游帶有強(qiáng)啟動(dòng)子，可促進(jìn)VEGF的表達(dá)；②局部組織缺血缺氧的刺激可使細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性VEGF，缺氧使該因子的降解緩慢，半衰期延長(zhǎng)，而這種內(nèi)源性的細(xì)胞因子還可以放大少量外源性的細(xì)胞因子的效應(yīng)[8]，導(dǎo)致VEGF在局部的蓄積而發(fā)揮作用；③VEGF與其受體之間存在正反饋，它可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體的高表達(dá)，從而放大VEGF的效應(yīng)。

我們的研究表明外源性的VEGF基因通過(guò)載體直接作用于局部可以在局部表達(dá)并刺激VEGF的分泌，后者可促進(jìn)局部血管的增生，改善移植組織的血供，為組織提供充足的營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)組織的成活，預(yù)示著它在組織移植中美好的應(yīng)用前景，但是要將該基因治療的方法真正應(yīng)用于臨床，尚有不少問(wèn)題需要解決。

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[收稿日期]2007-06-15 [修回日期]2007-09-11

編輯/張惠娟