以凍干骨為平臺重建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的研究

[摘要]目的：探索在兔凍干異體骨關(guān)節(jié)平臺上利用組織工程的方法再造人工關(guān)節(jié)軟骨的可行性。方法：實驗分成四組，運用組織工程方法將不同構(gòu)成的同種異體兔軟骨細(xì)胞-支架材料復(fù)合物種植于兔凍干異體骨關(guān)節(jié)平臺上，植入實驗兔體內(nèi)，3月后取材觀察體內(nèi)成軟骨情況。結(jié)果：僅種植兔軟骨細(xì)胞的凍干骨關(guān)節(jié)支架上未見新生軟骨形成。粘合有種植兔軟骨細(xì)胞的PLGA膜片的凍干骨支架關(guān)節(jié)腔內(nèi)見新生類軟骨樣物出現(xiàn)。自體軟骨層孔洞缺損模型使用軟骨細(xì)胞-PLGA膜片復(fù)合物可修復(fù)軟骨缺損。結(jié)論: 軟骨細(xì)胞-PLGA膜片復(fù)合物實驗動物關(guān)節(jié)內(nèi)可形成軟骨樣物；但在凍干骨關(guān)節(jié)平臺上尚不能形成有功能意義的關(guān)節(jié)軟骨層。

[關(guān)鍵詞]凍干骨； 聚羥基乙酸聚乳酸共聚物； 組織工程； 軟骨

[中圖分類號]Q819[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1337-03

Experimental study of the articular cartilage regeneration on the surface of the freeze-dried bone joint

WANG Yong-chun，SHEN Zun-li，SHEN Hua，QIAN Jun，ZHANG Zhao-feng，JIA Wan-xin，CAI Yan-xian

(Department of Plastic Surgery，Affiliated First People's Hospital of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200080，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of new cartilage formation on the surface of a freeze-dried bone joint by tissue engineering approach.MethodsThe chondrocytes-scafford constructs by tissue engineering were implanted into the rabbit joint defects. Samples were harvested 3 months post implantation to detect the cartilage formation.ResultsNew cartilage-like tissue can be seen on the surface of cell-PLGA constructs， however， it can not be found on the freeze-dried bone joint with only cell seeded. The defects of articular cartilage hole-model can be repaired with cell-PGLA chaff constructs.ConclusionAlthough chondrocytes-PLGA chaff constructs can be used in cartilage tissue engineering， they can not produce functional articular cartilage on the surface of the freeze-dried bone joint.

Key words: freeze-dried bone; PLGA; tissue engineering; cartilage

骨關(guān)節(jié)軟骨面的完好對關(guān)節(jié)功能的正常發(fā)揮有重要意義。經(jīng)凍干消毒處理的同種異體凍干骨移植后經(jīng)爬行替代作用可逐漸被自體骨取代[1]，但同種異體凍干關(guān)節(jié)軟骨組織凍干處理后軟骨細(xì)胞已基本滅活，移植后軟骨面會破壞吸收融合，無法供患者長期使用。我科室自20世紀(jì)80年代開始應(yīng)用凍干異體骨關(guān)節(jié)加拇甲瓣法再造手指280余例[2]，術(shù)后經(jīng)長期隨訪攝片觀察發(fā)現(xiàn)異體凍干骨可通過爬行替代作用逐漸被自體骨取代；而異體凍干關(guān)節(jié)軟骨大多破壞吸收[3-5]，致使再造指關(guān)節(jié)功能大多喪失，再造手指的功能受限，故此種方法一直得不到有效的臨床推廣。筆者設(shè)想應(yīng)用組織工程方法將軟骨種子細(xì)胞種植于同種異體凍干骨平臺上，植入實驗動物體內(nèi)觀察能否形成關(guān)節(jié)軟骨樣結(jié)構(gòu)，探討這一方法的可行性。

1材料和方法

1.1 實驗材料:3月齡日本大耳白兔40只及2周齡日本大耳白兔幼兔4只，雌雄不限（復(fù)旦大學(xué)動物實驗中心提供）。胰蛋白酶、II型膠原酶及DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。PLGA膜片購自Synthecon公司（連峰碩士惠贈）。兔抗II型膠原多克隆抗體和生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG購自武漢博士德。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干骨關(guān)節(jié)的制備和PLGA膜片的粘合：供體兔過量麻醉處死，取兔前足趾骨關(guān)節(jié)頭48個，其中10個截除關(guān)節(jié)面軟骨層，加工制成凍干骨關(guān)節(jié)[6]后環(huán)氧乙烷消毒塑料袋密封常溫保存?zhèn)溆?。PLGA膜用0.01%多聚賴氨酸中浸泡處理，裁剪成4mm×4mm大小膜片，取完整凍干骨關(guān)節(jié)及截除軟骨層凍干骨關(guān)節(jié)各8個，用生物蛋白膠粘合劑將PLGA膜片粘合在關(guān)節(jié)面端表面，環(huán)氧乙烷消毒塑料袋密封常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 種子軟骨細(xì)胞獲取、擴(kuò)增及軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物的體外構(gòu)建：采用林荔軍[7]法獲取種子軟骨細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞貼滿皿底后傳代擴(kuò)增。重復(fù)該過程至第三代細(xì)胞融合。將第三代軟骨細(xì)胞消化、計數(shù)、臺盼藍(lán)染色檢測擴(kuò)增的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活力95%以上，制成細(xì)胞濃度為5×107/ml的懸液備用。將經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后的四組材料(見表1) 分別置入四個培養(yǎng)皿中，用少量培養(yǎng)液濕化，用上述細(xì)胞懸液各5ml均勻滴在每個材料上，6h后加入培養(yǎng)液，以后每2天換液一次，培養(yǎng)至1周。

1.2.3 軟骨細(xì)胞-支架材料復(fù)合物動物體內(nèi)植入及觀察：成年日本大耳白兔32只，隨機(jī)分為A、B、C、D共4組，每組8只，分別植入相對應(yīng)組別的軟骨細(xì)胞-支架材料復(fù)合物。植入物種植于取左后足第2趾跖骨頭位置。A、B、C組實驗兔自跖骨頭下5mm水平咬骨鉗咬除跖骨關(guān)節(jié)頭，造成缺損長度在0.8cm左右，將相對應(yīng)的A、B、C組軟骨細(xì)胞-支架材料復(fù)合物按原解剖位置植入關(guān)節(jié)缺損處，39號醫(yī)用鋼絲骨斷端處環(huán)扎內(nèi)固定，關(guān)節(jié)復(fù)位，修復(fù)肌腱，關(guān)閉切口，酒精紗布包裹。D組實驗兔保留自體跖趾關(guān)節(jié)，跖骨關(guān)節(jié)頭軟骨全層用電鉆毀損，形成孔洞模型，直徑4mm，深度5mm，將軟骨細(xì)胞-PLGA材料復(fù)合物置入孔洞內(nèi)，關(guān)節(jié)復(fù)位，修復(fù)肌腱，關(guān)閉切口，酒精紗布包裹。術(shù)后四組實驗兔均予青霉素80萬單位肌注，1天2次，共3天。實驗兔單只籠內(nèi)放養(yǎng)，傷口均愈合良好，于3月后處死動物取材觀察及檢測。

2結(jié)果

2.1 大體觀察：A組表面未見明顯新生軟骨樣結(jié)構(gòu)。B組和C組關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見新生物出現(xiàn)，呈較典型的半透明類軟骨樣結(jié)構(gòu)形成；關(guān)節(jié)腔內(nèi)的新生物與凍干骨平臺無緊密粘連（圖1）。D組所有樣本關(guān)節(jié)面表面均基本修復(fù)完整，原孔洞處出現(xiàn)白色新生物，新生物外觀光滑，探針觸感質(zhì)地似軟骨樣，與周邊組織無明顯肉眼邊界（圖2）。

2.2 顯微鏡下觀察：HE染色可見A、B組凍干異體骨關(guān)節(jié)面表面軟骨組織吸收、裂解，局部破碎，軟骨陷窩處未見軟骨細(xì)胞存活，關(guān)節(jié)面處無新生軟骨層。B、C組關(guān)節(jié)腔內(nèi)獲得的類軟骨樣結(jié)構(gòu)鏡下可見典型軟骨光鏡下結(jié)構(gòu)特點，軟骨陷窩內(nèi)見活性細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周邊為均勻的軟骨基質(zhì)成分，軟骨樣結(jié)構(gòu)邊緣可見纖維結(jié)締組織成分（圖3）。D組鏡下可見新生軟骨樣結(jié)構(gòu)修復(fù)原自體關(guān)節(jié)面軟骨層孔洞缺損，新生軟骨樣組織與原自體關(guān)節(jié)孔洞缺損邊緣有較明顯組織學(xué)外觀差異，細(xì)胞形態(tài)較幼稚，但兩者粘合緊密（圖4）。II型膠原免疫組化染色均觀察到B、C組及D組HE染色顯微鏡下觀察到的軟骨結(jié)構(gòu)II型膠原棕褐色反應(yīng)，為陽性染色結(jié)果，證實新生物中存在特異性軟骨基質(zhì)成分。

3討論

支架材料是構(gòu)建組織工程軟骨的物質(zhì)基礎(chǔ)。軟骨種子細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增對微環(huán)境有特殊的要求。支架材料要能為種子細(xì)胞提供一個三維生長環(huán)境，使種子細(xì)胞在其中繁殖、生長、代謝，發(fā)揮細(xì)胞間的信號調(diào)控作用，不斷分泌細(xì)胞外基質(zhì)，以逐步取代降解的支架材料，最終形成有活性的軟骨組織。

關(guān)節(jié)軟骨為透明軟骨，組織學(xué)特點為軟骨陷窩周邊為大量軟骨基質(zhì)成分，形成較均勻緊密的結(jié)構(gòu)，故即使經(jīng)深低溫冷凍干燥處理，凍干骨關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨面組織仍然無法形成組織工程細(xì)胞培養(yǎng)所需的三維腔隙結(jié)構(gòu)，總體孔隙率不足以提供細(xì)胞生長、增殖、物質(zhì)交換所需的三維空間需求。故在單純凍干骨表面種植軟骨細(xì)胞進(jìn)行動物體內(nèi)實驗，筆者認(rèn)為形成新生組織工程化關(guān)節(jié)軟骨難度大。PLGA[8-9]材料由PGA和PLA共聚而成，具有優(yōu)良的生物相容性，無毒、可生物降解，可控性良好。本實驗選用的PLGA降解周期為6～8周。已有很多學(xué)者報道應(yīng)用PLGA支架材料在體外或?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)再造形成各種組織工程化軟骨[10]。前期試驗中，筆者觀察到凍干骨和聚羥基乙酸聚乳酸共聚物(PLGA)材料表面軟骨細(xì)胞均有粘附增殖及基質(zhì)分泌，但后者明顯優(yōu)于前者[11]。因此，筆者考慮在凍干骨支架上粘合PLGA材料使軟骨細(xì)胞獲得良好的生存環(huán)境，以利再造形成類關(guān)節(jié)軟骨樣結(jié)構(gòu)。

A組沒有產(chǎn)生新生軟骨樣組織。B組和C組關(guān)節(jié)腔內(nèi)產(chǎn)生了經(jīng)切片檢查證實的類關(guān)節(jié)軟骨樣組織。D組植入自體關(guān)節(jié)孔洞缺損3月后，取材觀察見所有樣本缺損處均基本修復(fù)，新生組織具有軟骨樣外觀及質(zhì)地。顯微鏡下見較典型的單一的軟骨組織。和A組相比較，這表明軟骨細(xì)胞-PLGA膜片在類關(guān)節(jié)軟骨樣組織的形成過程中起了決定性的作用。筆者分析，在凍干骨關(guān)節(jié)面表面由于沒有出現(xiàn)三維立體空間結(jié)構(gòu)，無法滿足軟骨細(xì)胞的營養(yǎng)代謝和物質(zhì)交換需求，故植入實驗兔體內(nèi)后軟骨細(xì)胞無法長期存活，難以重建軟骨層；與此相對應(yīng)，PLGA膜片為種植的軟骨細(xì)胞提供了需要的三維立體空間結(jié)構(gòu)，故在體內(nèi)產(chǎn)生了類關(guān)節(jié)軟骨樣組織。但是，筆者在顯微鏡下同時也觀察到B、C組關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)的并不是典型的關(guān)節(jié)軟骨層結(jié)構(gòu)，其與纖維結(jié)締組織共同出現(xiàn)，故筆者只是稱之為類關(guān)節(jié)軟骨樣組織；況且，這種類關(guān)節(jié)軟骨樣組織與凍干骨表面沒有產(chǎn)生緊密的組織學(xué)聯(lián)系，所以它們可能不具備關(guān)節(jié)軟骨層的組織學(xué)功能。

本實驗中異體軟骨細(xì)胞-PLGA支架材料復(fù)合物可修復(fù)D組的自體軟骨缺損，但在凍干骨支架上未能形成筆者預(yù)期的有組織學(xué)功能的新生關(guān)節(jié)軟骨層。A、B、C組植入術(shù)后形成的關(guān)節(jié)均為半自體、半異體所組成的復(fù)合關(guān)節(jié)，其營養(yǎng)供給必然受限；而D組的營養(yǎng)供給則要明顯充裕，有利于細(xì)胞的功能發(fā)揮和軟骨重建，故實驗結(jié)果理想。筆者認(rèn)為凍干骨的致密的組織形成的單層界面導(dǎo)致種植的軟骨細(xì)胞無充足營養(yǎng)供給也是其可能原因。

對此，筆者設(shè)想對凍干骨材料進(jìn)行一些改進(jìn)或許能實現(xiàn)之前的實驗?zāi)康?。雖然關(guān)節(jié)頭處軟骨層結(jié)構(gòu)致密，但軟骨層下方即為具有三維多孔疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的松質(zhì)骨；之前筆者制備去關(guān)節(jié)軟骨面凍干骨（C組）時在關(guān)節(jié)頸水平截骨，軟骨層下方的松質(zhì)骨也同時丟棄，骨斷面為致密皮質(zhì)骨，軟骨細(xì)胞或細(xì)胞支架材料復(fù)合物粘附生長不佳。筆者制備凍干骨支架時僅將致密軟骨層磨去而將軟骨層下方的松質(zhì)骨保存，或可脫鈣處理去除骨內(nèi)沉積的鈣鹽使支架材料結(jié)構(gòu)更為疏松，脫鈣骨基質(zhì)中含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)其分化和胞外基質(zhì)合成的能力。以此為細(xì)胞載體，可能這樣的凍干骨支架有助于形成有功能意義的關(guān)節(jié)軟骨層[12-13]。這些設(shè)想需留待今后的實驗進(jìn)一步驗證。

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[收稿日期]2007-06-18[修回日期]2007-09-25

編輯/張惠娟