組織工程軟骨實驗生物反應器的設(shè)計

[摘要]目的：設(shè)計一套計算機控制的組織工程軟骨實驗用灌流型生物反應器。方法：通過計算機控制時間及流量，利用蠕動泵、密閉的硅膠管、玻璃管、儲液瓶等串聯(lián)設(shè)計一套無菌的灌流型軟骨組織工程用生物反應器。 結(jié)果：生物反應器由控制系統(tǒng)和培養(yǎng)系統(tǒng)組成，運行良好，能置于培養(yǎng)箱中對軟骨細胞材料復合物進行動態(tài)培養(yǎng)。結(jié)論：反應器設(shè)計合理。整個生物反應器系統(tǒng)運行可靠。

[關(guān)鍵詞]組織工程；軟骨；生物反應器

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1328-03

Design of a bioreactor for constructing tissue engineered cartilage

HAN Xue-feng1，LI Jian-ning1，YANG Da-ping2，QIN Ze-lian1，HAO Chen-guang2，LIU Guo-feng2，GUO Tie-fang2，XU Jie3

（1.Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Beijing University； 2.Department of the 1st Orthopedic Surgery，the Second Hospital of Haerbin Medical University; 3 Department of General Surgery， the Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University， Shanghai 200072）

Abstracts:ObjectivesTo design a set of perfusion bioreactor which controlled by computer for constructing tissue engineered cartilage.MethodsTo control the rate and time of the flow by computer， and to construct a set of sterile perfusion bioreactor for cartilage tissue engineering， which was consist of peristaltic pump， plastic tubes， silicon gel tubes and media container in series.ResultsThe bioreactor was composed of control system and culture system，which moved well.The bioreactor can be put into incubator and culture cartilage in dynamic state. ConculsionThe bioreactor was resonable and reliable.

Key words: tissue engineering; cartilage; bioreactor

關(guān)節(jié)軟骨損傷后，自身能力修復有限，大于4mm的缺損需利用軟骨或其他材料修復。軟骨組織工程為軟骨修復提供又一有效途徑。正常狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨間斷受到應力，如直接壓力，關(guān)節(jié)液的流動產(chǎn)生的剪切力等。為促進組織工程軟骨體外成熟，很多作者引入灌流型生物反應器(Perfusion Bioreactor，PBR)來模擬體內(nèi)應力環(huán)境[1-4]，并取得良好效果。但前人設(shè)計的PBR普遍存在容量小，成本昂貴，如需不同時間取材則實驗耗時長等缺點。本實驗設(shè)計的生物反應器通過計算機控制不同時間、流量的培養(yǎng)液流動，模擬體內(nèi)的應力環(huán)境；并將多個反應箱串聯(lián)，可于短期內(nèi)培養(yǎng)大量不同時間取材的組織工程軟骨，以期改進PBR的功能。

1材料和方法

1.1 灌流型生物反應器的設(shè)計原則：生物反應器(Bioreactor，BR)是于體外向組織工程組織施加外力，以促進后者成熟的儀器。其可促進營養(yǎng)物質(zhì)交換，并使組織工程組織處于類似體內(nèi)的力學環(huán)境，從而提高后者生物學及力學性能。為達以上效果并方便實驗研究，軟骨組織工程PBR應遵循以下原則設(shè)計:可提供流體的剪切力；能夠促進營養(yǎng)物質(zhì)代謝；可調(diào)節(jié)流量及作用時間；具有多個反應箱，可在短期內(nèi)獲取大量的標本；系統(tǒng)透明，便于觀察；培養(yǎng)室的設(shè)計能保證培養(yǎng)液均勻地流過；成本低廉，制作、使用方便；污染可能性小等。

1.2 灌流型生物反應器的實驗材料：工控計算機，華北工控有限公司生產(chǎn)。蠕動泵，型號BT300-1J，河北保定蘭格恒流泵有限公司生產(chǎn)。硅膠管，pharmed蠕動泵細胞培養(yǎng)專用硅膠管，法國圣戈班公司生產(chǎn)。開關(guān)（不銹鋼輸液調(diào)節(jié)器），不銹鋼濾網(wǎng)及所有玻璃器皿、玻璃管道、膠塞均為哈爾濱一統(tǒng)化學化玻設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.3 灌流型生物反應器的設(shè)計：PBR是一套無菌的封閉循環(huán)系統(tǒng)，由控制器、蠕動泵、儲液瓶、反應箱以及連接管道組成（圖１、圖２）?？刂破骷从嬎銠C，其內(nèi)裝應用軟件Matlab，經(jīng)本實驗室人員許杰[5-6]編程后可任意控制液體流量緩慢升高、降低、往返流動及作用時間。蠕動泵通過采集卡與計算機相連，接受計算機的指令，流量為0～100ml/min。儲液瓶內(nèi)可儲存培養(yǎng)液250ml，每周換2次液，每次換出80ml。瓶口由膠塞封閉，其上連接2個直徑0.22μm的一次性塑料濾膜，1個為通氣濾膜，保持培養(yǎng)液的氣體環(huán)境，1個為換液濾膜，新鮮的培養(yǎng)液通過其注入儲液瓶中，確保注入液體無菌；其上連接的2個玻璃管道均探入瓶底，保證液體往返流動時整個管道無氣體進入。反應箱由內(nèi)徑5mm，管壁厚度0.5mm，長度3.5cm的玻璃管構(gòu)成，每一反應箱內(nèi)放入1個標本，各反應箱由硅膠管連接，其間由100目不銹鋼濾網(wǎng)間隔，防止標本隨液流沖走。連接管道由玻璃直管及三通、硅膠管、一次性塑料三通、開關(guān)組成。玻璃管內(nèi)徑5mm，管壁厚0.5mm，直管長度分別為4cm和12cm，三通呈150，150，60度角度，各臂長4cm。硅膠管內(nèi)徑5mm，管壁厚度3mm，可與玻璃管緊密貼合。一次性塑料三通為換液時使用，將需要換掉的液體從儲液瓶中抽出，而不從此向內(nèi)注液，減少污染機會。開關(guān)作用：將標本置于反應箱后，硅膠管旁路的開關(guān)全部關(guān)閉，反應箱兩側(cè)開關(guān)打開，培養(yǎng)液串聯(lián)流過標本，每一標本所受外力相同。在第一次取材時，關(guān)閉第一組反應箱兩側(cè)開關(guān)，打開硅膠管旁路開關(guān)，取出標本，而不影響余下標本的實驗。第二次取材時依此類推，可以在短時間內(nèi)獲取大量標本。整個系統(tǒng)除蠕動泵及計算機外均可以通過高溫高壓消毒。

2結(jié)果

PBR已設(shè)計制作完成。實物布置如圖2B所示。蠕動泵及計算機置于孵箱外。系統(tǒng)體積小，安放靈活，可任意放置于托盤上。整個系統(tǒng)運行良好、穩(wěn)定。

3討論

常規(guī)的靜態(tài)培養(yǎng)條件下，組織工程組織易形成“空巢”現(xiàn)象。其原因主要是由于支架中心部位低分子的代謝產(chǎn)物主要通過滲透的方式向表面轉(zhuǎn)移，不利于細胞代謝廢物的排泄及營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，最終導致細胞向支架表面遷移，中心部位形成組織量較少，出現(xiàn)“空巢”[7]。同時，因培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)生理應力環(huán)境相去甚遠，形成的組織工程組織力學特性與生理性組織也有一定差距[1-3，7-10]。

為解決營養(yǎng)物質(zhì)的交換障礙及模擬體內(nèi)力學環(huán)境，以期形成更加成熟的組織工程組織，人們設(shè)計了各種BR。目前軟骨組織工程用BR主要分為三種形式：旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)壁型[8-9]，灌流型[1-4]，直接作用力型[10]。所有BR均可促進組織工程軟骨成熟，其中旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)壁型和灌流型最為常用。在PBR的研究中，Raimondi， MT等[1]將人軟骨細胞與可降解支架DegraPol形成復合物，置于灌流型的反應箱內(nèi)，受到0.5ml/min的流量沖擊，4周后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液流過復合物組細胞合成能力最強，電鏡顯示細胞形態(tài)也最好，“空巢”現(xiàn)象不明顯。Mahmoudifar， N等[2-3]利用自行研制的生物反應器研究不同流量下組織工程軟骨在其中的生物學及力學性能，結(jié)果均顯示了灌流液體可以促進組織工程軟骨的成熟。國內(nèi)的呂曉杰等[4]使用灌流型和液壓型相結(jié)合的生物反應器作用于組織工程軟骨，與常規(guī)的靜態(tài)培養(yǎng)相比，流體的剪切力和壓力能夠促進組織工程軟骨成熟。因此，PBR對于成功構(gòu)建較大和較厚的軟骨組織和克服中空等缺陷具有重要的作用。

前述PBR[1-4]基于PBR原則設(shè)計，如提供可控制的流體剪切力，使用透明裝置便于觀察，密閉性好污染機會少等。本實驗設(shè)計的PBR總結(jié)前人經(jīng)驗，與以往相比，具有以下特點：①引入計算機對動力系統(tǒng)行數(shù)字控制，因此流量及時間控制精確，可以節(jié)省人力和物力；②具有串聯(lián)的多個反應箱，可置入大量標本并保證所受外力均勻；③引入通道旁路系統(tǒng)，取標本后不影響下一步的實驗進度，節(jié)省大量的實驗時間和人力，可短時間內(nèi)能夠獲得大量的的標本；④儲液瓶設(shè)計成雙濾膜通氣及換液，原因為培養(yǎng)液通過濾膜后，濾膜濕潤，通氣功能喪失，如果只使用1個濾膜，隨著蠕動泵不斷向儲液瓶中泵入液體，儲液瓶中氣壓升高，瓶口膠塞彈起，造成污染，此種設(shè)計可有效減少污染。

本PBR將力學因素與營養(yǎng)傳輸充分考慮，對組織工程軟骨施加流體的剪切力可通過計算機任意控制，營養(yǎng)傳輸通過液體的流動有機結(jié)合。通過我們對此生物反應器的進一步研究和不斷改進，必將有力地推動軟骨組織工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和臨床推廣應用。

[參考文獻]

[1]Raimondi MT， Boschetti F， Falcone L， et al. The effect of media perfusion on three-dimensional cultures of huma chondrocytes: Integration of experimental and computational approaches[J]. Biorheology，2004，41(3-4):401-410.

[2]Mahmoudifar N， Doran PM. Tissue engineering of human cartilage in bioreactors using single and composite cell-seeded scaffolds[J].Biotechnol Bioeng，2005， 91(3):338-355.

[3]Mahmoudifar N， Doran PM. Tissue engineering of human cartilage and osteochondral composites using recirculation bioreactors[J].Biomaterials， 2005， 26(34):7012-7024.

[4]呂曉杰，周廣東，李 宏，等.灌流-液壓式反應器體外構(gòu)建組織工程化軟骨[J].上海交通大學學報，2006，26(9)：1006-1010.

[5]Xu， J， Ge， H， Zhou， X，et al. Tissue engineering scheming by artificial intelligence[J].Int J Art Org，2005，28(1):74-78.

[6]Xu， J， Zhou， X， Yang， D， et al. Applying informatics in tissue engineering[J]. Methods of Information in Medicine，2005，44(1):38-43.

[7]Sikavitsas VI， Bancroft GN， Mikos AG. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor[J].J Biomed Mater Res，2002，62(1):136-148.

[8]Chen， HC， Lee HP， Ho YC， et al.Combination of baculovirus-mediated gene transfer and rotating-shaft bioreactor for cartilage tissue engineering[J]. Biomaterials， 2006， 27(16): 3154-3162.

[9]余方圓，郭全義，黃利虹，等.去分化關(guān)節(jié)軟骨細胞生物反應器培養(yǎng)反分化的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2006，20（8）：840-844.

[10]Ha Y， Wei YG. Physical Signals and Solute Transport in Cartilage under Dynamic Unconfined Compression: Finite Element[J]. Analysis Annals of Biomedical Engineering， 2004，32(3)380-390.

[收稿日期]2007-06-11 [修回日期]2007-09-08

編輯/張惠娟