病理性瘢痕中結(jié)締組織生長因子的免疫組化研究

病理性瘢痕是臨床上的常見病、多發(fā)病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。結(jié)締組織生長因子：connective51ssue growth factor，CTGF)是一種促纖維化生長因子，在病理情況下，CTGF的過度表達(dá)與某些增生性或纖維化性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如硬皮病、腎纖維化、肝硬化、肺纖維化等。本實(shí)驗(yàn)旨在通過應(yīng)用免疫組化(SABC法)染色，圖像分析等方法，觀察CTGF在病理性瘢痕中表達(dá)的差異性，以探討兩者之間的內(nèi)在關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本來源及實(shí)驗(yàn)分組：全部瘢痕疙瘩病例均屬于增生期。病例入選標(biāo)準(zhǔn)還包括：2年內(nèi)未接受藥物注射、放射或外科治療；1個(gè)月內(nèi)未予任何外用藥治療；無系統(tǒng)疾病者；無局部皮膚病變。標(biāo)本均來源于本科。全部共75例，其中男33例，女42例：年齡12～63歲，平均(34±13)歲；病程1～20年，平均(8.28±7.05)年。對(duì)照組15例正常人皮膚均取自健康個(gè)體軀干上部。其中男6例，女9例：年齡12～53歲，平均(30±13)歲。實(shí)驗(yàn)分8組：NS組(正常皮膚組)、SS組(淺表性瘢痕組)、HSS組(增生性瘢痕邊緣組)、HSM組(增生性瘢痕中間組)、HSN組(增生性瘢痕邊緣外正常皮膚組)和KS組(瘢痕疙瘩邊緣組)、KM組(瘢痕疙瘩中間組)、KN組(瘢痕疙瘩邊緣外正常皮膚組)。所有標(biāo)本切取后用PBS沖洗，修剪去皮下脂肪，經(jīng)10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5μm，分別經(jīng)HE和免疫組織化學(xué)染色。

1．2 主要試劑與儀器：兔抗人CTGF多克隆抗體、既用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。真彩醫(yī)學(xué)圖像分析儀為德國Leica公司MD－20型。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 HE染色：按照常規(guī)方法進(jìn)行。

1．3．2 免疫組織化學(xué)染色：采用SABC法，石蠟包埋標(biāo)本、切片后，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；3％過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶；0.02mol／L檸檬酸微波修復(fù)；非免疫性動(dòng)物血清封閉非特異性抗原；山羊抗人CTGF多克隆抗體稀釋度為1:100，4℃孵育過夜；按sP試劑盒說明加生物素標(biāo)記的二抗，孵育30min后加標(biāo)記過氧化酶的鏈霉親和素孵育30min：DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。半數(shù)切片不經(jīng)蘇木精復(fù)染，留作圖像分析，其余切片經(jīng)蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。同時(shí)取乳腺癌及結(jié)腸癌的標(biāo)本做陽性對(duì)照。顯微鏡觀察。

1．3．3 形態(tài)計(jì)量學(xué)及圖像分析：免疫組化切片的染色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒，陰性對(duì)照片無棕黃色著色。將免疫組化切片置于相同強(qiáng)度光線顯微鏡下，觀察表皮、真皮中棕黃色顆粒的表達(dá)數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)度；并觀測(cè)其形態(tài)及其分布特征。8組病例分別進(jìn)行上述觀察。每例隨機(jī)抽取1張CTGF染色切片用圖像分析系統(tǒng)分別進(jìn)行檢測(cè)。在40倍物鏡下每張切片自表皮向真皮深層按系統(tǒng)抽樣法隨機(jī)抽取5個(gè)視野，測(cè)定棕黃色陽性顆粒的總面積及平均光密度值，然后計(jì)算出單位面積的面密度值。

1．3．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，樣本兩兩比較用q檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判斷均數(shù)差異顯著性，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HE染色：觀察結(jié)果基本與文獻(xiàn)報(bào)道相同。

2．2 免疫組織化學(xué)染色：陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞漿，空白對(duì)照片無棕黃色著色。KS組織中CTGF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)最多，可見大量彌漫性分布的成纖維細(xì)胞，著色較深，排列紊亂，極性消失，主要分布于真皮層膠原結(jié)節(jié)處，大部分呈強(qiáng)陽性著色，特別是真皮深層；表皮基底層也有少量陽性細(xì)胞，著色較淡。并且在瘢痕組織的邊緣，CTGF表達(dá)呈現(xiàn)由強(qiáng)變?nèi)醯倪^渡現(xiàn)象。在KN組織中也有較強(qiáng)的表達(dá)。在HS組織，陽性細(xì)胞分布與KS相同，但數(shù)量少，著色較淡。主要集中于中間部。而在HN組織中的表達(dá)極微弱。SS和NS組織中僅有極微弱的CTGF陽性著色，主要在表皮基底層。

2．3 圖像分析：各組CTGF陽性顆粒面密度值見表1；平均光密度值見表2。

3 討論

3．1 CTGF是1991年Bradham等通過應(yīng)用抗血小板源生長因子抗體篩選人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eDNA文庫基因表達(dá)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。它主要由皮膚成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肺纖維連接蛋白、血管平滑肌細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞合成分泌。其作用主要表現(xiàn)為促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞粘附、刺激細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)肉芽組織形成和纖維化、促進(jìn)軟骨及骨骼發(fā)育等。它被視為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF－β)的下游反應(yīng)元件，而TGF－β被認(rèn)為是促進(jìn)纖維化發(fā)展最重要的細(xì)胞因子，其在病理性瘢痕發(fā)病機(jī)制中所處的重要作用已被證實(shí)。在瘢痕形成過程的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究中，CTGF對(duì)成纖維細(xì)胞的分化增殖，具有很強(qiáng)的調(diào)控作用，而CTGF的異常高表達(dá)在瘢痕形成過程的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，已成為瘢痕形成過程新的研究熱點(diǎn)。

3．2 本實(shí)驗(yàn)通過逐組圖像分析，計(jì)算出能夠反映CTGF蛋白陽性表達(dá)率高低的面密度值(視野中被分析物體的總面積／視場(chǎng)面積)和反映CTGF蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度高低的平均光密度值(整個(gè)視野中每一點(diǎn)的光密度的疊加／點(diǎn)數(shù)的總和)，以便充分顯示各組中CTGF的表達(dá)差異。結(jié)果顯示CTGF主要表達(dá)于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織真皮層的成纖維細(xì)胞中，且兩者的陽性表達(dá)率及陽性表達(dá)強(qiáng)度均較正常皮膚和淺表性瘢痕中明顯增強(qiáng)，但又有瘢痕疙瘩強(qiáng)于增生性瘢痕的差異，說明增生性瘢痕和瘢痕疙瘩既有瘢痕增生的共同特性，又有增生程度及活性不同的差異。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩外一定范圍的正常皮膚也有較強(qiáng)的表達(dá)，而與之外觀極其相似的增生性瘢痕外正常皮膚表達(dá)與正常皮膚無明顯差別，這預(yù)示瘢痕疙瘩具有侵襲正常皮膚的特性，而增生性瘢痕則無侵襲性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與增生性瘢痕的預(yù)后及治療效果明顯好于瘢痕疙瘩的臨床事實(shí)基本一致。結(jié)果說明CTGF在病理性瘢痕發(fā)病機(jī)制中可能起到了非常重要的作用，或者說參與了病理性瘢痕的形成。

3．3 TGF－β除能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和促進(jìn)組織纖維化外，尚有抗炎和抗細(xì)胞分化等功能，由于其作用的靶細(xì)胞種類繁多、生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜，因此，完全阻斷其表達(dá)或活性，可能引起細(xì)胞生長失控、免疫失調(diào)、嚴(yán)重炎癥等不良反應(yīng)。而CTGF作為TGF－β的下游介質(zhì)，生物學(xué)效應(yīng)較單一，可能僅介導(dǎo)TGE－β的促纖維化效應(yīng)，其作用范圍也主要局限于結(jié)締組織。通過阻斷CTGF可能減輕TGF－β誘導(dǎo)組織纖維化的效應(yīng)，同時(shí)保留TGF－β有利的抗炎癥和抗腫瘤細(xì)胞增生的效應(yīng)?？梢哉J(rèn)為，CTGF是一種特異性更強(qiáng)并且具有選擇性干預(yù)結(jié)締組織形成過程的細(xì)胞因子。因此，應(yīng)用一些阻斷CTGF的表達(dá)或抑制其生物活性的物質(zhì)，如抗CTGF中和抗體或CTGF反義分子等，選擇性地作用于CTCF靶位，有可能成為將來治療瘢痕疙瘩及其它纖維化疾病的更特異、更有效的方法。