Ｐ物質(zhì)抑制劑辣椒素和ｂＦＧＦ抗體對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖協(xié)同抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討P物質(zhì)抑制劑一辣椒素及bFGF抗體單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)體外培養(yǎng)的人體增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法：體外培養(yǎng)12例增生性瘢痕組織的成纖維細(xì)胞，分別加入不同濃度的辣椒素或／和bFGF抗體，培養(yǎng)24h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果：所有不同濃度的辣椒素(2.5，5，20，40，60，80mg／L)均能使細(xì)胞皺縮、壞死、抑制細(xì)胞增殖，其抑制作用隨劑量增大而增加。中高濃度bFGF抗體(40，80mg／L)也可促使細(xì)胞皺縮、壞死，抑制細(xì)胞增殖，其抑制作用也隨劑量增大而增加。辣椒素與bFCF抗體聯(lián)合應(yīng)用對(duì)成纖維細(xì)胞抑制作用較單獨(dú)使用效果更顯著(P0.05)。結(jié)論：辣椒素及bFGF抗體可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，其抑制作用隨濃度增加而增加，兩者聯(lián)合使用有協(xié)調(diào)作用本研究結(jié)果可能在增生性瘢痕的治療提供新的思路和手段。

[關(guān)鍵詞]P物質(zhì)抑制劑(辣椒素)；抗bFGF抗體；增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

創(chuàng)傷、燒傷以及手術(shù)傷口愈合后出現(xiàn)的增生性瘢痕不僅影響患者的外觀，同時(shí)還會(huì)伴有傷口局部的瘙癢。發(fā)生在功能部位還可出現(xiàn)瘢痕攣縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，是困擾外科領(lǐng)域的一大難題。因此，有關(guān)增生性瘢痕的防治研究一直是這個(gè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過用P物質(zhì)抑制劑辣椒素及bFGF抗體單獨(dú)或聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，探討辣椒素及bFGF抗體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增生的抑制作用，以期為增生性瘢痕的治療提供新的方法。

1 材料和方法

1．1 主要試劑：辣椒素、bFGF抗體及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司。辣椒素純度＞95％，辣椒素用無水乙醇、生理鹽水按1:9溶解并配成所需實(shí)驗(yàn)濃度。

1．2 標(biāo)本收集：取增生性瘢痕標(biāo)本12例，其中男性5例，女性7例，年齡在11～34歲，均取自燒、創(chuàng)傷后3～6個(gè)月的增生性瘢痕標(biāo)本。

1．3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：按組織塊法行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。將手術(shù)獲取的增生性瘢痕組織標(biāo)本去除表皮和皮下脂肪后，修剪成0.5～1.0mm大小的組織塊，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液漂洗，置于37℃、5％CO細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代。實(shí)驗(yàn)選用第5～6代細(xì)胞。

1．4 辣椒素及bFGF抗體對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞影響的形態(tài)學(xué)觀察：將培養(yǎng)好的成纖維細(xì)胞分成四組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液DMEM，辣椒素組加入含辣椒素終濃度分別為：2.5，5，10，20，40和80mg／L的DMEM培養(yǎng)液；bFGF抗體組加入抗bFGF抗體濃度分別為：20，40和80mg／L的DMEM培養(yǎng)液；辣椒素及抗bFGF抗體組加入含不同濃度的辣椒素(2．5，5，10，20，40和80mg／L)及抗hFGF抗體(20mg/L)；空白對(duì)照組僅加入DMEbl培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h．顯微鏡下(日本OlympusCH型)觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1．5 MTT法檢測(cè)辣椒素及bFGF抗體對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞抑制率：用胰酶將細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整懸液中成纖維細(xì)胞的密度，以1×10／L，按2001μ1／孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48h，吸出原培養(yǎng)液，辣椒素組加入含辣椒素終濃度分別為：2．5，5，10，20，40和80mg／L的DMEM培養(yǎng)液200μ1；bFGF抗體組加入抗bFGF抗體濃度分別為：20，40和80mg／L的DMEM培養(yǎng)液；辣椒素及抗bFGF抗體組加入含不同濃度的辣椒素(2.5，5，10，20，40和80mg／L)及抗bFGF抗體(20mg／L)；空白對(duì)照組加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)(每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔)20h，加入預(yù)先配好MTT溶液20μ1繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光度值(OD值)，并按下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。

抑制率％＝(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)／宅白組OD值×100％

1．6 統(tǒng)計(jì)方法：數(shù)值用(x±s)表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2．1 對(duì)照組成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)照組加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好，增殖情況良好，大部分細(xì)胞成梭形，聚集成堆，少數(shù)剛分裂細(xì)胞尚未伸展開，成小圓形。

2．2 P物質(zhì)抑制劑辣椒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響：應(yīng)用辣椒素培養(yǎng)組，部分細(xì)胞皺縮成圓形，隨著辣椒素濃度增加，細(xì)胞壞死增多，濃度至80mg／L時(shí)約有一半細(xì)胞壞死。

2．3 bFGF抗體對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響：應(yīng)用bFGF抗體培養(yǎng)組，見部分細(xì)胞皺縮成圓形，隨著bFGF抗體濃度增加，細(xì)胞壞死增多，濃度至80mg/L時(shí)約有一半細(xì)胞壞死。

2．4 聯(lián)合使用P物質(zhì)抑制劑和bFGF抗體對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響：各濃度的P物質(zhì)抑制劑與20mg／L的BFGF抗體聯(lián)合應(yīng)用，細(xì)胞發(fā)生皺縮，體積變小，形狀變圓，并堆積在一起，并可見許多漂浮的壞死細(xì)胞，隨著P物質(zhì)抑制劑濃度增加，壞死細(xì)胞增多，濃度為80mg/L時(shí)，大部分細(xì)胞已經(jīng)壞死(抑制率92.97％±6.84％)。20mg/LbFGF或2.5mg／L P物質(zhì)抑制劑并沒有顯著抑制細(xì)胞增殖，但兩者聯(lián)合使用可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(抑制率15.47％±4.44％，與20mg/LbFGF或2.5mg／LP物質(zhì)抑制劑單獨(dú)刺激組相比P＜0.05)。

3 討論

增生性瘢痕是由于燒傷、創(chuàng)傷及其他原因?qū)е缕つw真皮層損傷后局部瘢痕組織過度生長(zhǎng)的結(jié)果。成纖維細(xì)胞是瘢痕組織中的主要細(xì)胞成分，它的過度增殖則是增生性瘢痕形成的細(xì)胞基礎(chǔ)，探討如何抑制增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞增殖問題一是抑制瘢痕增生研究的重點(diǎn)。

目前研究表明，P物質(zhì)在正常皮膚組織中有分布，在成纖維細(xì)胞上也有表達(dá)，它是～種神經(jīng)肽類物質(zhì)，在增生性瘢痕組織中的分布比正常皮膚及非增生性瘢痕組織中明顯增多。而神經(jīng)肽受體的表達(dá)具有可塑性，P物質(zhì)在增生性瘢痕形成時(shí)，P物質(zhì)的受體也在隨之增多，說明在組織修復(fù)及增生性瘢痕形成過程中P物質(zhì)及受體起一定的作用。P物質(zhì)及其受體增加可能是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的原因之一。辣椒素是P物質(zhì)抑制劑，是從紅辣椒中提取的一種植物堿，具有局部抗炎、鎮(zhèn)痛、止癢效果。研究表明，辣椒素可導(dǎo)致培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。本試驗(yàn)應(yīng)用辣椒素作用于體外培養(yǎng)的人體增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)隨著辣椒素濃度的增加，其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖與活力有明顯的抑制作用。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一種多肽類生長(zhǎng)因子，它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，是組織損傷過程中的重要環(huán)節(jié)，但成纖維細(xì)胞的過度增生又會(huì)形成瘢痕。Ono I的研究證實(shí)人體的傷口分泌物中bFGF、TGF－β等因子的含量明顯升高，這些物質(zhì)在瘢痕增生時(shí)持續(xù)較高的水平，推測(cè)bFGF在增生性瘢痕形成過程中應(yīng)起有一定的作用。bFGF是FGFs家族中最重要的成員，當(dāng)bFGF與其酪氨酸激酶型受體結(jié)合后，主要通過激發(fā)細(xì)胞內(nèi)cAMP一蛋白激酶A和／或二酰基甘油-IP3(1，4，5一三磷酸肌醇)-蛋白激酶-c途徑發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而刺激成纖維細(xì)胞增殖和移行，促進(jìn)膠原等胞外基質(zhì)合成，誘導(dǎo)細(xì)胞移行、血管新生和肉芽組織形成。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗bFGF抗體作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖與活力也有明顯的抑制作用，提示它作為bFGF的抗體對(duì)bFW具有拮抗作用，繼而抑制成纖維細(xì)胞的增殖。

已有報(bào)道bFGF抗體可部分阻斷P物質(zhì)對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用。P物質(zhì)有上調(diào)bFGF表達(dá)的作用，因此我們推測(cè)P物質(zhì)抑制劑辣椒素可抑制P物質(zhì)上調(diào)bFSF表達(dá)的作用；P物質(zhì)抑制劑和抗bFGF抗體聯(lián)合可產(chǎn)生協(xié)同作用。為驗(yàn)證上述可能的假想，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用辣椒素及抗bFSF抗體作用于體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖與活力均有明顯的抑制作用，其抑制作用較辣椒素或bFGF抗體單獨(dú)使用更強(qiáng)，這表明聯(lián)合應(yīng)用兩者治療增生性瘢痕具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。