先天性小耳畸形家系收集和遺傳學(xué)研究

[摘要]目的：收集和利用先天性小耳畸形家系資源進行相關(guān)的遺傳學(xué)研究。方法：通過對住院患者及其家屬家族史的詢問調(diào)查，收集先天性小耳畸形家系；利用收集的家系資源進行先證者核型分析和vrkl基因突變檢測。 結(jié)果：于2005年9月～2007年3月，收集先天性小耳畸形家系7個；對7個家系先訌者的核型分析和vrkl基因突變檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。 結(jié)論：先天性小耳畸形家系核型正常，初步排除了vrk1基因在先天性小耳畸形發(fā)病中的作用。

[關(guān)鍵詞]先天性小耳畸形；家系；遺傳學(xué)研究

先天性小耳畸形是繼唇、腭裂之后最為常見的面部畸形，也是導(dǎo)致面部不對稱的最常見先天性畸形。先天性小耳畸形病因尚不明確，遺傳是發(fā)病因素之一，家系是研究遺傳因素的重要資源。我們于2005年9月～2007年3月，通過對中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院住院患者及其家屬家族史的詢問調(diào)查，收集了先天性小耳畸形家系7個，并進行了相關(guān)的遺傳學(xué)研究。

1 材料和方法

1．1 家系收集

1．1．1 先證者一級親屬中(包括父母、同胞及子代)至少有一人為先天性小耳畸形患者，即家系中至少兩人為先天性小耳畸形患者；對于所有接受檢查的家系成員告知對本研究的知情，并在自愿的情況下簽寫知情同意書。

1．1．2 從先證者出發(fā)，追溯家庭成員的親緣關(guān)系，應(yīng)用Cyrillic2.1軟件繪制家系圖譜。

1．1．3 對于簽寫知情同意書的人員抽取外周血約5ml，用于進行細胞遺傳學(xué)檢測和制備DNA。

1．2 染色體顯帶檢測

1．2．1 細胞培養(yǎng)：取0.3ml肝素鈉抗凝靜脈全血接種于15％小牛血清、適量抗生素和PHA的RPMll640培養(yǎng)基中，放37℃恒溫箱中培養(yǎng)，至36h后加入終濃度為7.3×10mol／ml的秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。

1．2．2 染色體制備：用0.075mol／L的Kcl低滲處理兩次，每次10min，3:1甲醇、冰醋酸固定，第1次10min，第2次15～20min，空氣干燥制片。

1．2．3 G顯帶：將制備出的標本放于37℃恒溫箱中5～7天，然后用0.025％的胰酶37℃條件下處理15～20s，8％Giemsa常溫下染色20min后鏡檢。

1．3 vrk1基因突變篩查

1．3．1 外周血DNA的提?。撼Ｒ?guī)苯酚、氯仿抽提DNA。

1．3．2 PCR反應(yīng)：vrkl基因設(shè)計引物覆蓋了vrkl所有編碼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子交界處的引物11對(外顯子1為非編碼區(qū)故未設(shè)計引物檢測)。應(yīng)用25μ1的PCR反應(yīng)體系，包含基因組DNA0.5μ1，5U／μ1Ampli Taq polymerase0.5μ1，10xPCR緩沖液2.5μ1，10mmol／L dNTPs1μ1，primer0.5μ1，雙蒸去離子水補足致25μ1。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性15min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 55s，10個循環(huán)；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，22個循環(huán)；72℃充分延伸5min；4℃保存。取2μ1PCR擴增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效果。

1．3．3 測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，進行雙向DNA測序，測序由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司完成。將測序結(jié)果與基因庫中的正常序列進行對比分析。

2 結(jié)果

2．1 先天性小耳畸形家系收集：我們共收集了7個先天性小耳畸形家系。

2．2 染色體核型檢測：對7個家系的先證者(5男2女)經(jīng)過染色體顯帶技術(shù)的檢查，結(jié)果核型正常，為46XY或46XX，且未發(fā)現(xiàn)有染色體的異常。

2．3 vrk1基因突變檢測：對7個家系先證者的vrk1基因檢測未發(fā)現(xiàn)存在基因突變。

3 討論

家系在遺傳因素的研究中具有重要作用。目前業(yè)內(nèi)普遍認為，找到某一復(fù)雜性狀相似呈單基因遺傳的家系，是克隆復(fù)雜性狀的相關(guān)基因的最佳途徑。正是如此，國內(nèi)外學(xué)者以及國內(nèi)外較高級別的研究資助機構(gòu)普遍認同一個觀點：找到大家系，即找到人類遺傳的全部所在。疾病家系就是“基因資源”，成為各國保護和爭奪的對象。我國是一個擁有豐富的先天性小耳畸形病種資源的大國，因此，保護、利用和研究我國寶貴的遺傳家系是迫在眉睫的工作。

我們利用收集的家系進行了細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)檢測。絕大多數(shù)先天性小耳畸形的染色體核型檢測是正常的，但少數(shù)患者出現(xiàn)染色體畸形，目前報道的包括：5p染色體缺失，6q單體性染色體，8q染色體缺失，18三體，21環(huán)狀染色體，22q缺失，22三體，47XXY。除此以外，還有報道染色體鑲嵌現(xiàn)象，包括7三體鑲嵌，9三體鑲嵌。我們針對收集的7個家系的先證者進行的染色體核型檢測未發(fā)現(xiàn)核型和染色體的異常。

侯選基因(candidate gene approach)結(jié)合基因定位的方法進行分子遺傳學(xué)研究，是近幾年隨著人類疾病基因研究的進展而發(fā)展起來的一種基因鑒定的方法，是根據(jù)某種遺傳病和特定基因分別定位于染色體的同一區(qū)域，而發(fā)現(xiàn)并鑒定其基因突變，由此定位和克隆基因；也可從疾病的表型出發(fā)，選取表型相似的已知基因，對其突變進行檢測，研究其致病基因。如在分子遺傳學(xué)研究中能夠靈活運用候選基因法，可能會獲得意想不到的成果。

Kelberman等收集了半側(cè)顏面短小(hemifa cial microsomia)家系，首次通過全基因組掃描、連鎖分析的方法將其致病基因定位于14q21，位于微衛(wèi)星標記物D14S987、D14S65之間約為10.7厘摩的區(qū)域。先天性小耳畸形可以看作半側(cè)顏面短小的微小表現(xiàn)形式(microform)，因此我們通過http：／／genome.UCSC.edu，查詢微衛(wèi)星標記物D14S987和D14S65之間的基因及其功能，共尋找到7個知名基因，通過對這些基因功能的分析，我們選擇對細胞凋亡起重要調(diào)節(jié)作用的基因，并且在軟組織、軟骨和骨髂組織都有表達的基因作為候選基因，符合以上條件的基因首選vrk1(vaccinia re－lated kinase 1)。但通過對于7個先天性小耳畸形家系先證者的基因檢測，初步排除了vrkl基因突變。

微衛(wèi)星標記物D14S987和D14S65之間還存在6個知名基因：BDKRBI(bradykiMn receptor BJ)，BDKRB2(bradv，kinin receptor B2)，AK7(adeny－late kinase 7)，C14orfl03(chromosome 14 openreading frame 103)，C14orfl29(chromosome 14open reading frame 129)和PAPOLA(polv(A)polymerase alpha)，因此進一步針對這些基因進行突變檢測是我們將要繼續(xù)開展的研究。但應(yīng)當了解隨著基因克隆和鑒定技術(shù)的完善，微衛(wèi)星標記物D14S987和D14S65可能還會有新的基因作為候選基因出現(xiàn)，這將增加先天性小耳畸形致病基因鑒定的難度，但相信隨著研究的深入進展，必將能夠揭開先天性小耳畸形神秘的面紗。