人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存方法的改進(jìn)

[摘要]目的：探索理想的冷凍人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 方法：采用常規(guī)方法體外培養(yǎng)并擴(kuò)增人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，消化細(xì)胞并洗滌離心加入10％二甲基亞砜、30％胎牛血清、60％MEM的細(xì)胞凍存體系，直接置-70℃冰箱貯存。凍存4、8和12周后，37℃水浴復(fù)溫，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞表型和成脂的多向分化潛能，以鑒定該方法的可行性。結(jié)果：消化后不經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的程序性降溫凍存技術(shù)，直接在-70℃冰箱贍存，其細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)明顯改變，細(xì)胞仍存在成脂的多向分化潛能。結(jié)論：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液直接-70℃冰箱貯存不影響其生：物學(xué)特性，是冷凍保存的一種可行方法。

[關(guān)鍵詞]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；分化；脂肪細(xì)胞；冷凍貯存

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下，可以分化為成骨、軟骨、脂肪等多種細(xì)胞，是組織工程，尤其是骨或軟骨組織損傷修復(fù)中重要的種子細(xì)胞。因此，對(duì)其體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增及保存方法等研究具有重要的意義。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，原代細(xì)胞鋪滿的時(shí)間約2周以上，達(dá)到實(shí)驗(yàn)用的數(shù)量一般需要3劇左右。我們?cè)诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代容易發(fā)生自發(fā)分化，失去其多向分化的潛能。為保證實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，隨時(shí)提供大量的實(shí)驗(yàn)或組織工稗用的種子細(xì)胞，建立～種行之有效的方法是必要的，通過(guò)檢測(cè)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞周期，細(xì)胞表型和成脂的多向分化潛能來(lái)鑒定凍存方法的可靠性。

1 材料和方法

1．1 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng)：脂肪組織來(lái)源于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院美容中心行脂肪抽吸術(shù)的患者，身體健康。無(wú)菌條件下，在局部腫脹麻醉下采用注射器法抽取50ml脂肪組織，靜置半小時(shí)，去除上清液體，獲得純度較高的脂肪顆粒，用等容的D-Hank’s平衡鹽液清洗4次，去除細(xì)胞碎片。然后用150ml HBSS(含0.075％膠原酶I)，在37℃，振動(dòng)消化1h。膠原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后離心1200r，10min。細(xì)胞被懸浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目篩網(wǎng)過(guò)濾。離心后，細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。加至培養(yǎng)瓶，37℃，C0孵箱中培養(yǎng)24h，未貼壁的細(xì)胞和殘?jiān)怀?，新鮮培養(yǎng)液加至貼壁細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至80％融合時(shí)，用胰酶／EDTA消化和按1:1的比例傳代。

1．2 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存及復(fù)蘇：取原代或擴(kuò)增培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)瓶吸棄培養(yǎng)體系，胰酶／EDTA消化，加PBS洗滌后加入現(xiàn)配的含10％DMSO、30％胎牛血清的MFM的凍存體系，按12ml／瓶將瓶底面積鋪滿，密封瓶口，用包裹兩層，平整存放于至-70℃低溫冰箱。存不同時(shí)間后，取出含細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，放入水溫38℃～40℃的恒溫水浴箱快速解凍。此時(shí)操作應(yīng)避免劇烈晃動(dòng)，以免使細(xì)胞損傷，待冰塊基本融化后棄上清，用PBS洗滌2次，加入MEM的培養(yǎng)體系，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。需要注意的是，細(xì)胞凍存體系必須配制后再加入細(xì)胞中，各種成分不能單獨(dú)加入，并且凍存的細(xì)胞盡可能短時(shí)間存放在液體狀態(tài)下的凍存體系中。

1．3 凍存前后人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定：培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化離心(1000r／min，5min)后細(xì)胞重懸；細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10／L，分別于人抗CD34、CD44、CD45、CE108、CD49d和HLA－DR單克隆抗體室溫反應(yīng)30min，PBS洗滌2次后于FITC標(biāo)記的二抗避光作用30min。用PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．4 凍存前后人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的測(cè)定：培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化離心(1000r／min，5min)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNaseA處理30min，PI染色10min。用Cellquest軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞，ModiFit分析細(xì)胞周期。

1．5 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的誘導(dǎo)：取凍存前后的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)：細(xì)胞以2×10細(xì)胞／孔接種于6孔培養(yǎng)板，其中含有1μmol／L的地塞米松、0.5mmol／L的甲基黃嘌呤異丁酯、100mmol，／L的消炎痛、10％的胎牛血清DMEM(試劑均為終濃度，SIGMA公刮產(chǎn)品)。

2 結(jié)果

2．1 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化、擴(kuò)增培養(yǎng)及形態(tài)特征：倒置生物顯微鏡下觀察，接種后48h，極少數(shù)細(xì)胞貼壁，呈梭形，4天后細(xì)胞呈纖維集落樣生長(zhǎng)，大約8～10天，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)并形成克隆，2周左右細(xì)胞近80％～90％匯合，出現(xiàn)致密的貼壁層。繼續(xù)培養(yǎng)，可見(jiàn)有自發(fā)分化的現(xiàn)象出現(xiàn)不典型的聚集的小脂泡。

2．2 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：脂肪千細(xì)胞均一的表達(dá)CD44、CD106陽(yáng)性，而CD34、CD45、CD49d和HLA－DR呈陰性表達(dá)。CD49d和CD106是脂肪干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的很好的區(qū)分標(biāo)記。冷凍前后的表型鑒定無(wú)明顯區(qū)別。

2．3 冷凍保存后的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞存活率及細(xì)胞周期的變化：分別將在-70℃低溫冰箱凍存4周、8周和12周的細(xì)胞38℃～40℃水浴中復(fù)蘇，直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞。次日收獲人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，凍存后細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示：我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞處于G／G1期，僅少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期與凍存前比較沒(méi)有明顯的變化。倒置生物顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，與凍存前比較沒(méi)有明顯形態(tài)的區(qū)別，并且凍存4、8、12周的細(xì)胞形態(tài)之間沒(méi)有明顯差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，-70℃凍存的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不會(huì)明顯改變細(xì)胞的細(xì)胞周期特點(diǎn)。從本研究的結(jié)果來(lái)看，凍存前的貼壁細(xì)胞應(yīng)以70％～80％長(zhǎng)滿為宜，復(fù)蘇后基本完全存活。

2．4 凍存復(fù)蘇的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：凍存12周后復(fù)蘇細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力。用臘肪誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)1周后即有60％～80％的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，用油紅染色后在胞漿內(nèi)出現(xiàn)密集的紅色顆粒。當(dāng)誘導(dǎo)12天時(shí)，100％的細(xì)胞出現(xiàn)油紅染色陽(yáng)性反應(yīng)。

3 討論

Zuk等的研究建立了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。自此，有關(guān)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的研究逐漸深入。我們以往的工作分析了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性，并證實(shí)其可以分化為成骨、脂肪等細(xì)胞。但是我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在傳代過(guò)程中，其細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，增殖變緩。甚至細(xì)胞發(fā)生自發(fā)分化現(xiàn)象。為了解決這個(gè)問(wèn)題，并給以后的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用提供有效數(shù)量的種子細(xì)胞，我們摸索改進(jìn)了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存方法。

在傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法中，一種是程序性降溫凍存法，另一種則是非程序性降溫凍存法，其中包括-80℃～-196℃兩步法和直接-80℃一步法常規(guī)的程序性降溫液氮凍存法，其步驟復(fù)雜費(fèi)時(shí)，而且需購(gòu)置費(fèi)用昂貴的專用儀器。20世紀(jì)80年代Till等采用HES／DMSO作為冷凍保護(hù)劑，以非程序降溫-80℃冰箱凍存外周血干細(xì)胞獲得成功。我們利用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，探索在70℃冰箱內(nèi)以非程序降溫凍存消化后的人脂肪問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)過(guò)低溫冷凍保存后的細(xì)胞經(jīng)3代傳代，細(xì)胞表型和分化潛能不發(fā)生明顯改變。解凍后的細(xì)胞存活率很高?？梢?jiàn)，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在-70℃冰箱內(nèi)短期冷凍保存是一種可行的方法。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為，凍存方法的關(guān)鍵在于選擇合適的冷凍細(xì)胞密度，這是保證細(xì)胞凍存效果的重要條件。細(xì)胞密度太小，細(xì)胞之間沒(méi)有連接，增殖速度會(huì)很緩慢。但是如果密度過(guò)大，復(fù)蘇后的細(xì)胞增殖沒(méi)有適當(dāng)?shù)目臻g使貼壁細(xì)胞容易脫落。此外，在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)工作中我們還發(fā)現(xiàn)，過(guò)密的貼壁細(xì)胞易造成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化而使其失去干細(xì)胞的特性，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖緩慢，傳代次數(shù)減少。因此，-70℃冰箱內(nèi)細(xì)胞凍存法可以概括為如下優(yōu)點(diǎn)：①縮短了凍存步驟，短期內(nèi)并沒(méi)有改變細(xì)胞的生物學(xué)特性；②低溫冰箱凍存細(xì)胞不需要液氮及液氮凍存裝置，降低了細(xì)胞的凍存成本；③方法簡(jiǎn)便快捷、易操作，能較快地?cái)U(kuò)增足量的細(xì)胞，大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間。本研究為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供了保證。