５９５ｎｍ激光對(duì)兔耳瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

[摘要]目的：探討595nmVbeam激光照射對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型傷口愈合過程中成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法：成年大耳白兔20只，建立兔耳腹側(cè)面增生性瘢痕模型，對(duì)比研究在瘢痕形成過程中595tlmVbeam激光照射對(duì)兔耳瘢痕成纖維細(xì)胞的影響，采用免覆組化方法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的原位檢測。結(jié)果：兔耳增生性瘢痕經(jīng)595nmVbeam激光照射后，按不同時(shí)間段取材進(jìn)行免疫組化染色并與對(duì)照組比較，高倍鏡下觀察結(jié)果，顯示PCNA蛋白表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞凋亡增加。結(jié)論：595nmVbeam激光照射可抑制兔耳增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖過程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。應(yīng)用595nmVbeam激光預(yù)防和治療瘢痕是可行的。

[關(guān)鍵詞]vbeam激光；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；免耳瘢痕模型；細(xì)胞凋亡

瘢痕形成是美容醫(yī)學(xué)臨床上的一個(gè)常見問題，是燒傷或手術(shù)等創(chuàng)傷后常見的并發(fā)癥，但目前沒有一種治療可以從根本上阻止瘢痕的發(fā)生或者獲得令人滿意的療效。Vbeam激光是一種波長為595nm的脈沖染料激光，近年來脈沖染料激光應(yīng)用于臨床治療各種血管性病變的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)瘢痕有一定作用。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用兔耳瘢痕模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察595nmVbeam激光對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其對(duì)增生性瘢痕治療作用的機(jī)制，為應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療增生性瘢痕提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳白兔20只，雌雄不限，體重1.5～2.0kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2 主要試劑：Ⅰ抗鼠抗兔PCNA單克隆抗體、Ⅱ抗羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購于羅氏公司。

1．3 主要儀器設(shè)備：595nm Vbeam激光血管治療儀(美國CANDELA公司生產(chǎn))；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1．4 建立動(dòng)物模型：將大耳白兔分籠飼養(yǎng)2天后，按文獻(xiàn)報(bào)道方法建立增生性瘢痕動(dòng)物模型，即在3％戊巴比妥那麻醉下，用圓形鉆刀在每只兔耳腹側(cè)誣沿長軸避開血管，各做4個(gè)直徑6mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，深達(dá)軟骨表面，每個(gè)創(chuàng)面間隔2cm以上，共做160個(gè)。術(shù)后常規(guī)抗感染，自由進(jìn)食。術(shù)后21天，160個(gè)創(chuàng)面中有103個(gè)創(chuàng)面愈合突出于皮膚表面，即形成增生性瘢痕。

1．5 實(shí)驗(yàn)分組：創(chuàng)面上皮化后切取一組增生性瘢痕8處(A組)，然后將形成的增生性瘢痕隨機(jī)分為兩組，分別為激光治療組和對(duì)照組。激光治療組在創(chuàng)面上皮化后開始進(jìn)行激光照射，采用Vbeam激光血管治療儀，波長595nm，本組采用的治療參數(shù)是光斑直徑7mm，發(fā)射頻率1.5Hz，脈寬1.5～6ms，能量密度7～11J／cm，動(dòng)態(tài)冷卻發(fā)射時(shí)間和間隔時(shí)間均為30ms。開始時(shí)每周照射一次，一個(gè)月后改為每兩周照射一次，共兩個(gè)月。對(duì)照組不進(jìn)行治療。

1．6 標(biāo)本取材及處理：在上皮化后1、2、4、6、8周分別切除兩組增生性瘢痕各8處(B，c，D，E，F(xiàn)組)，加上上皮化后切取的一組瘢痕，共計(jì)取材88處。各組組織均4％多聚甲醛固定48h后常規(guī)脫水，石蠟包埋，擬行PCNA蛋白測定和細(xì)胞凋亡的原位檢測。

1．7 觀察指標(biāo)

1．7．1 PCNA蛋白測定：應(yīng)用常規(guī)2步免疫組化法，按試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，細(xì)胞核內(nèi)含有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。在400倍光鏡下觀察結(jié)果，每張切片找5個(gè)陽性細(xì)胞最多的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽性細(xì)胞反應(yīng)率(％)=陽性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100％，結(jié)果取均數(shù)。

1．7．2 細(xì)胞凋亡的原位檢測：采用TUNEL法，按步驟操作。細(xì)胞核內(nèi)含有淡棕黃色至深棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。400倍光鏡下觀察結(jié)果，隨機(jī)選擇3個(gè)陽性細(xì)胞最多的高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，死亡率以凋亡細(xì)胞／細(xì)胞總數(shù)×100％表示，結(jié)果取均數(shù)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：每組樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即(x±s)表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

納入實(shí)驗(yàn)大耳白兔20只，實(shí)驗(yàn)中無脫落，均進(jìn)入結(jié)果分析。

2．1 PCNA檢測：可見表皮基底細(xì)胞層，棘細(xì)胞層，顆粒層和大量真皮成纖維細(xì)胞及真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞較多增殖細(xì)胞核抗原陽性表達(dá)。上皮化后增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞反應(yīng)率為18.33％，以后隨時(shí)間推移逐漸增高，至上皮化后4周達(dá)高峰。從上皮化后1周開始可見激光治療組增殖細(xì)胞核抗原蛋白表達(dá)較對(duì)照組減弱，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組差異具有極顯著性(P＜0.01)，具體見表1。上皮化后4周，對(duì)照組增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，激光治療組增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)減弱。

2．2 細(xì)胞凋亡原位檢測結(jié)果：在成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮中可見凋亡小體，即凋亡細(xì)胞。在瘢痕形成的早期，僅有少量陽性細(xì)胞，隨時(shí)間推移凋亡細(xì)胞逐漸增加，在上皮化4周時(shí)凋亡細(xì)胞較前明顯增多，真皮中見較多凋亡的成纖維細(xì)胞，而到了上皮化6周時(shí)才達(dá)到凋亡高峰，至上皮化8周時(shí)凋亡指數(shù)仍然持續(xù)很高。從上皮化后4周開始，兩組瘢痕凋亡率有極顯著性差異，P＜0.01，上皮化后6周時(shí)對(duì)照組凋亡細(xì)胞，激光治療組凋亡細(xì)胞增多。

3 討論

創(chuàng)傷修復(fù)過程中，由于全身和局部因素的影響，?？蓪?dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積和膠原降解減少而形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩，病理表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的大量增殖和膠原的過度沉積。而且在不同的形成階段有著不同的臨床表現(xiàn)和發(fā)展趨勢，不僅嚴(yán)重影響外貌和功能，也會(huì)造成患者心理的異常。目前對(duì)于增生性瘢痕的治療方法很多，用于防治瘢痕的藥物研究也非常多，但人們對(duì)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成的原因尚不完全明了，臨床療效還不盡如人意。

激光治療增生性瘢痕始于20世紀(jì)70年代后期。激光治療瘢痕的原理是利用激光的燒灼、氣化、切割、凝固及散焦等特有作用，去除瘢痕組織或損傷瘢痕內(nèi)血管、抑制膠原合成和細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。應(yīng)用脈沖染料激光治療瘢痕始于20世紀(jì)90年代初期，原理在于其能特異作用于微血管。1994年Alster報(bào)道了應(yīng)用585nm閃光燈泵浦染料激光治療靜止期紅斑性增生性瘢痕，經(jīng)皮膚紋理分析和臨床觀察等研究證實(shí)1到2次治療就有明顯改善。Vbeam激光血管治療儀也是一種脈沖染料激光，波長為595nm，由于其波長更長，對(duì)組織的穿透也更深。其脈寬具有可調(diào)性，有1.5ms、6ms、lOms、20ms、30ms、40ms，可根據(jù)不同病變適當(dāng)選擇，超長脈寬使組織有更長時(shí)間吸收激光能量，得到溫和加熱和均勻凝結(jié)，會(huì)取得更好的治療效果。另外該激光儀還配有動(dòng)態(tài)冷卻系統(tǒng)，既能有效降低激光熱效應(yīng)對(duì)皮膚的損害又能減輕病人的疼痛，在治療血管性疾病中起到良好效果。應(yīng)用脈沖染料激光治療瘢痕的原理在于抑制小血管的形成并閉合小的血管，來加重瘢痕缺氧程度并減少生長因子及成纖維細(xì)胞來源，從而預(yù)防并治療瘢痕。由于增生性瘢痕早期含有大量毛細(xì)血管，微循環(huán)灌注過度，瘢痕外表呈鮮紅色。激光通過其光熱溶解作用，破壞組織細(xì)胞，使毛細(xì)血管叢凝固，組織缺血缺氧，乳酸代謝增加，pH值降低，顆粒細(xì)胞溶解后脫顆粒釋放膠原酶；血流減少后巨球蛋白含量下降，可間接增強(qiáng)膠原酶活性，膠原分解增加。另外激光的高熱溶解作用可使膠原骨架斷裂，促進(jìn)膠原結(jié)構(gòu)重建，瘢痕變軟，體積變小。

成纖維細(xì)胞增殖活性在增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。而其增殖活性又分為增殖分化功能和細(xì)胞外基質(zhì)的合成分泌功能。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在DNA復(fù)制過程中起重要作用。PCNA的表達(dá)已證實(shí)與細(xì)胞的增殖狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，是由基因控制的、細(xì)胞自主的、有序的死亡過程。細(xì)胞凋亡不僅參與正常創(chuàng)傷愈合的組織重建，而且在增生性瘢痕的形成、消退過程中亦扮演十分重要的角色。當(dāng)某些原因?qū)е略錾择：劢M織中的細(xì)胞凋亡數(shù)減少，則阻礙增生性瘢痕成熟；相反，若通過某種物理的或化學(xué)的手段來誘導(dǎo)或促進(jìn)瘢痕組織中的細(xì)胞凋亡，則加快增生性瘢痕的消退。脈沖染料激光對(duì)血管的作用已經(jīng)得到證實(shí)，而其對(duì)成纖維細(xì)胞增殖與凋亡活性的作用還鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)用脈沖染料激光作用于兔耳增生性瘢痕，通過與對(duì)照組比較增殖細(xì)胞核抗原蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的變化來確定595nm Vbeam脈沖染料激光對(duì)兔耳增生性瘢痕形成過程的影響，證實(shí)其對(duì)增生性瘢痕的預(yù)防及治療作用。經(jīng)免疫組化分析證實(shí)增殖細(xì)胞核抗原PCNA表達(dá)從上皮化后開始逐漸增加，至上皮化后4周達(dá)高峰。經(jīng)595nm Vbeam脈沖染料激光照射后，激光治療組增殖細(xì)胞核抗原PCNA表達(dá)從上皮化后1周開始同對(duì)照組比較可見明顯減弱，提示成纖維細(xì)胞的增殖活性降低。TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率顯示在兔耳傷口上皮化后僅有少量凋亡細(xì)胞，在上皮化后4周時(shí)凋亡細(xì)胞有所增加，而凋亡高峰在上皮化后6～8周才出現(xiàn)。經(jīng)595nm Vbeam脈沖染料激光照射后，治療組在上皮化后4周起凋亡率與對(duì)照組比較就有明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在增生性瘢痕形成過程中應(yīng)用Vbeam脈沖染料激光照射，可抑制成纖維細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕兔耳瘢痕增生程度，從而驗(yàn)證了Vbeam激光照射對(duì)兔耳增生性瘢痕具有預(yù)防和治療作用。而且這種新型激光利用瞬間的高能量作用，既消除病變又不造成周圍組織的燒傷，還能使膠原纖維平順緊密，可以產(chǎn)生美容效果。但其對(duì)于人類增生性瘢痕的作用還有待于進(jìn)一步的研究。