病理性瘢痕中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的免疫電鏡觀察

[摘要]目的：研究結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在病理性瘢痕組織中的表達(dá)定位，以探討其在病理性瘢痕中的作用及與病理性瘢痕形成的關(guān)系。方法：分別留取正常皮膚2例、淺表性瘢痕3例、增生性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚、瘢痕疙瘩及瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚各5例組織標(biāo)本，用特異性抗體作為標(biāo)記物，用膠體金作示蹤物進(jìn)行免疫電鏡觀察，觀察標(biāo)記物所在位置，以了解在不同組織中表達(dá)水平的差異性。結(jié)果：CTGF在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚中的表達(dá)均明顯高于正常皮膚、淺表性瘢痕及增生性瘢痕邊緣正常皮膚。免疫電鏡標(biāo)記顯示成纖維細(xì)胞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰，金顆粒呈團(tuán)狀、點(diǎn)灶狀分布，特異性強(qiáng)，CTGF蛋白陽(yáng)性標(biāo)記主要位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體、膠原纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、橋粒連接、常染色質(zhì)等部位也有表達(dá)。結(jié)論：CTGF與病理性瘢痕的形成有相關(guān)性，在其發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)：病理性瘢痕；免疫電鏡；膠體金

[中圖分類號(hào)]R392.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)07－0871－03

臨床上常見(jiàn)的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是皮膚對(duì)創(chuàng)傷、炎癥、燒傷應(yīng)激的一種過(guò)度的皮膚纖維增生性疾病，其形成原因至今尚未完全探明。隨著研究的深入，人們漸漸認(rèn)識(shí)到結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth fac－tor，CTGF)與病理性瘢痕密切相關(guān)。闡明CTGF在病理性瘢痕中的表達(dá)特點(diǎn)、分布規(guī)律、病理性瘢痕中超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等一系列問(wèn)題將對(duì)最終揭示瘢痕的形成機(jī)制等提供科學(xué)的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用特異性抗體作為標(biāo)記物，用膠體金作示蹤物進(jìn)行免疫電鏡觀察，觀察標(biāo)記物所在位置，以分析比較標(biāo)記物在不同組織中表達(dá)水平的差異性，探討CTGF的表達(dá)與病理性瘢痕形成的相關(guān)性。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本來(lái)源及實(shí)驗(yàn)分組：瘢痕疙瘩的診斷參照1991年James標(biāo)準(zhǔn)，且均屬于增生期。病例入選標(biāo)準(zhǔn)還包括：2年內(nèi)未接受藥物注射、放射或外科治療：1個(gè)月內(nèi)未予任何外用藥治療；無(wú)系統(tǒng)疾病者。無(wú)局部皮膚病變。標(biāo)本均來(lái)源于濰坊市人民醫(yī)院美容整形科?？偣灿袠?biāo)本15例，其中男6例，女9例：年齡18－48歲，平均(30±14)歲；病程1－20年，平均(5.28±4.02)年。瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例，淺表性瘢痕組3例，正常皮膚對(duì)照組2例(均取自健康個(gè)體軀干上部)。實(shí)驗(yàn)分6組：NS組(正常皮膚組)、SS組(淺表性瘢痕組)、HS組(增生性瘢痕組)、HSN組(增生性瘢痕邊緣外正常皮膚組)和K組(瘢痕疙瘩組)、KN組(瘢痕疙瘩邊緣外正常皮膚組)。

1．2 主要試劑與儀器：兔抗人CTGF多克隆抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。lOnm膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG及山羊血清封閉液購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。電鏡為日本產(chǎn)H－7500型透射電鏡。

1．3 免疫電鏡膠體金標(biāo)記：取新鮮各組標(biāo)本各取5例組織，修成lmm³大小，0.25％戊二醛(0.1mol/L，pH7.4二甲砷酸鈉緩沖液配制)4℃固定2h，不經(jīng)鋨酸固定，常規(guī)脫水Epon812包埋，聚合(37℃：12h，45℃:24h)，70nm超薄切片撈于無(wú)支持膜的200目不銹剛網(wǎng)上。①10％H₂O₂，10mim雙蒸水3×2min；TBS(pH7.4，Tris－HCI緩沖液)，3×2min；②1:20的羊血清白蛋白封閉30mim③兔抗人CTGF多克隆抗體，1:50，4℃冰箱過(guò)夜；④室溫復(fù)溫1h，pH7.4TBS噴洗，5×3min；pH8.2TBS(含1％BSA)洗，3×2mim⑤10nm金標(biāo)羊抗兔IgG，室溫2h；⑥pH8.2TBS洗，5×3mimpH 7.4TBS洗3×3mim⑦1％戊二醛固定15min，雙蒸水洗2次；⑦醋酸雙氧鈾10min，枸櫞酸鉛5min，復(fù)染。用TBS代替一抗作空白對(duì)照，其他步驟相同，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

膠體金標(biāo)記的陽(yáng)性信號(hào)為電鏡下所見(jiàn)的致密、規(guī)則、反差比較大的、高電子密度圓形或近圓形顆粒。陰性對(duì)照無(wú)此顆粒。

電鏡下：瘢痕與正常皮膚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰，保存良好。瘢痕超微結(jié)構(gòu)顯示以成纖維細(xì)胞的改變最顯著，成纖維細(xì)胞數(shù)量多、細(xì)胞體積大、胞漿豐富，胞漿內(nèi)有發(fā)達(dá)的細(xì)胞器，主要是大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞核亦增大，核質(zhì)豐富，核仁明顯。所有6組標(biāo)本中均出現(xiàn)了膠體金標(biāo)記CTGF陽(yáng)性顆粒，金顆粒呈圓形，電子密度高而清晰。在表達(dá)定量指標(biāo)上，與免疫組化中的表達(dá)結(jié)果基本一致(另文發(fā)表)。在表達(dá)定位指標(biāo)上有所區(qū)別，在正常皮膚和淺表性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚組織中金顆粒表達(dá)較少，金顆粒呈點(diǎn)灶狀分布。在正常皮膚主要位于基底細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，真皮乳頭層有散在少量表達(dá)；在淺表性瘢痕組織中表達(dá)亦較少，主要定位于基底細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)有散在少量表達(dá)；在增生性瘢痕邊緣正常皮膚組織中，金顆粒主要見(jiàn)于成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，膠原原纖維及細(xì)胞外基質(zhì)有散在少量表達(dá)。在瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚和增生性瘢痕組織中，膠體金顆粒表達(dá)明顯增多，金顆粒呈團(tuán)狀、點(diǎn)灶狀分布，標(biāo)記主要位于成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，此外，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體、膠原原纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、橋粒連接、常染色質(zhì)等部位也有表達(dá)，聚集的膠體金顆粒清楚可見(jiàn)，特異性強(qiáng)，最多的一團(tuán)金顆粒達(dá)上百枚?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)CTGF特異性金標(biāo)顆粒。

3 討論

3．1 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞因了、微循環(huán)、免疫、膠原代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及調(diào)亡、氧自由基等各方面進(jìn)行了深入的研究，但是任何一個(gè)單的因素都不能完整解釋病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為病理性瘢痕是多種因素共同作用的結(jié)果。目前所知與外傷、燒傷、于術(shù)、感染、異物、機(jī)體局部膠原代謝失調(diào)、遺傳及局部免疫功能等多種因素有關(guān)。其中細(xì)胞因子是眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)，深入研究相關(guān)因子，可能為最終揭示病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)治療提供依據(jù)。

3．2 CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，被視為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，(TGF-β，)的下游反應(yīng)元件，它的上述作用已在多種纖維化疾病的研究中得到證實(shí)。在瘢痕形成過(guò)程的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究中，CTGF對(duì)成纖維細(xì)胞的分化增殖，具有很強(qiáng)的調(diào)控作用，而CTGF的異常高表達(dá)在瘢痕形成過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，已成為瘢痕形成過(guò)程新的研究熱點(diǎn)。在間允質(zhì)細(xì)胞中CTGF可以快速選擇性的被TGF-β₂誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β₂可以直接激活CTGF基因的轉(zhuǎn)錄，在CTGF的啟動(dòng)子序列128－162的位置上存在著一個(gè)重要的TGF-β₂調(diào)控元件，后者的點(diǎn)突變可以導(dǎo)致TGF-β₂活性的完全喪失。故認(rèn)為CTGF是TGF-β₂致纖維化作用的下游效應(yīng)介質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。

3．3 本實(shí)驗(yàn)用特異性抗體作為標(biāo)記物，用膠體金作示蹤物進(jìn)行免疫電鏡觀察，觀察標(biāo)記物所在位置，發(fā)現(xiàn)CTGF主要定位于瘢痕成纖維細(xì)胞胞漿中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這同免疫組化研究CTGF主要定位于成纖維細(xì)胞胞漿相一致。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體、膠原纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、橋粒連接等部位也有表達(dá)。也有定位于核內(nèi)、常染色質(zhì)。在正常皮膚中免疫組化見(jiàn)CTGF呈弱陽(yáng)性表達(dá)，主要在表皮基底層細(xì)胞。而免疫電鏡下CTGF主要在基底細(xì)胞有陽(yáng)性表達(dá)顆粒，在成纖維細(xì)胞胞漿中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅有少量表達(dá)，這可能與CTGF在正常皮膚表達(dá)較弱有關(guān)。而在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕甚至在瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚中表達(dá)均較正常皮膚、淺表性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚明顯增強(qiáng)，說(shuō)明這些組織纖維增生活躍，該結(jié)果顯示瘢痕疙瘩與增生性瘢痕既有纖維增生活躍的共同特性，又有區(qū)別。增生性瘢痕邊緣正常皮膚與正常皮膚、淺表性瘢痕表達(dá)基本相同，預(yù)示其治療效果要明顯好于瘢痕疙瘩患者，這與臨床治療效果基本一致。CTGF陽(yáng)性顆粒為何出現(xiàn)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，推測(cè)這與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能特性有關(guān)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能就是合成細(xì)胞外基質(zhì)等分泌性蛋白。在病理情況下，細(xì)胞外基質(zhì)分泌過(guò)多，從而可引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致瘢痕形成。

3．4 人CTGF做為一種具有潛在應(yīng)用意義的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代前期，其作用機(jī)理等基礎(chǔ)工作仍需深入。CTGF是一種重要的促纖維化因子，作為TGF/SMADs途徑的下游介質(zhì)參與病理性瘢痕的形成。通過(guò)阻斷CTGF可能減輕TGF-β誘導(dǎo)組織纖維化的效應(yīng)，同時(shí)保留TGF-β有利的抗炎癥和抗腫瘤細(xì)胞增生的效應(yīng)。CTGF的分泌失調(diào)可能與病理性瘢痕的發(fā)生和進(jìn)展有極為密切的關(guān)系，調(diào)控瘢痕局部CTGF的表達(dá)，對(duì)延緩瘢痕進(jìn)展，可能有積極意義。