血管生成素協(xié)同血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對自體脂肪移植血運重建的影響

[摘要]目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)及血管生成素(ANG)協(xié)同VEGF對大鼠自體脂肪移植血運重建的影響。方法：在顆粒脂肪移植的實驗動物模型中應(yīng)用纖維蛋白原緩釋VEGF，作用于血管生成素浸泡過的自體脂肪細(xì)胞，免疫組化法觀察實驗組和各對照組移植體血管生長情況，并測量各組脂肪移植體剩余體積量。 結(jié)果：實驗組脂肪組織移植體血供重建良好，實驗組脂肪塊剩余體積明顯大于對照組。 結(jié)論：VEGF能加快脂肪移植的血運重建，ANG能協(xié)同VEGF作用，從而顯著提高自體脂肪移植成活率。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；血管生成素；脂肪移植

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0891－04

自體脂肪組織移植已有上百年的歷史，由于其來源豐富、取材容易、無排斥反應(yīng)等優(yōu)點，倍受整形美容外科醫(yī)生的重視；但移植后的脂肪成活率較低，極大地限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。如何提高自體脂肪組織移植的成活率是目前在這方面的研究熱點，并已取得一定的成果。目前普遍認(rèn)為VEGF是一種最重要的血管生成因子，其生物特性在臨床中的應(yīng)用日益受到重視。在我們的實驗中，應(yīng)用纖維蛋白原緩釋VEGF，ANG協(xié)同VEGF作用，能明顯地加快脂肪移植體的血運重建，從而顯著提高脂肪移植成活率。

1 材料和方法

1．1 實驗動物和試劑：SD大鼠90只，雌性，0.20－0.25kg，由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。人VEGF165(human VEGF165，hVEGF，ONCOGEN，美國)；重組人的血管生成素(ANG－1)(購于美國RD公司)：5％纖維蛋白原(海南醫(yī)學(xué)院蛋白研究所提供)；兔抗大鼠CD31多克隆抗體、SABC法試劑盒(購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗分組：90只雌性SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組30只。①空白對照組：單純行自體脂肪移植；②實驗對照組：2μg/mlANG－1 lml浸泡過的脂肪移植體內(nèi)加入5％纖維蛋白原20μl及125U/ml凝血酶10μl；③實驗組：2μg/mlANG－1 lml浸泡過的脂肪移植體與5％纖維蛋白原20μl、125U/ml凝血酶10μl及1μg VEGF均勻混合后移植。

1．2．2 實驗步驟：實驗動物麻醉(2％戊巴比妥2.3ml/kg)、固定、脫毛、消毒、鋪巾，于左側(cè)腹股溝上約1cm作平行腹股溝斜行切口，打開腹腔，夾出輸卵管旁脂肪，切取測量1ml脂肪組織，縫合切口。背部脫毛消毒，距脊柱旁開1cm作一小皮膚切口，皮膚肉膜下作分離，形成直徑1.5cm的圓形腔隙，小紗塊止血，取出的脂肪塊用顯微剪小心剪碎成細(xì)小顆粒狀，加入相應(yīng)的藥物。其中實驗組和實驗對照組放入裝有2μg/ml Ang－1的燒杯中浸泡備用，再加入相應(yīng)的藥物，然后將各組小心填入已分離好的腔隙中，仔細(xì)縫合背部傷口。

1．2．3 取材與標(biāo)本處理：術(shù)后7、14、28、42、64天取各組6只大鼠，取出脂肪移植體并測量其脂肪剩余體積，10％福爾馬林固定。常規(guī)制作石蠟切片，每個標(biāo)本切片5張，厚4μm，其中一張作HE染色，4張做免疫組化。

1．2．4 指標(biāo)觀察：①術(shù)后7、14、28、42、64天取材，標(biāo)本用微刻度試管測量其剩余的體積；②HE染色后光鏡下觀察移植體組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；③每張免疫組化切片分別在周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)各選4個高倍(×400)視野，每個視野中進(jìn)行微血管計數(shù)。參照Weidner計數(shù)方法計算出每mm²面積內(nèi)微血管的量即血管密度，然后求其均值。凡是染成棕色單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個血管計數(shù)，管腔大于8個紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層的血管均不納入計數(shù)。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)分析：結(jié)果以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，行t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 光鏡下移植體形態(tài)觀察：標(biāo)本行HE染色，光鏡下觀察移植體組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。實驗組移植脂肪組織：脂肪細(xì)胞大小較均一，存在大量小體積脂肪細(xì)胞，有少量的纖維組織間隔，部分區(qū)域淋巴細(xì)胞浸潤，被膜較厚且完整。空白對照組和實驗對照組：大部分移植物纖維化，僅少量脂肪組織存在，大量淋巴細(xì)胞浸潤，可見較大區(qū)域壞死灶，囊樣脂肪池。部分動物移植的脂肪幾乎完全吸收，只遺留薄層纖維組織。各組移植體內(nèi)均可見新生血管形成，新生血管分布不均，邊緣密集而中央較稀疏。在各期不論是移植體邊緣還是移植體中央部，實驗組均較空白對照組和實驗對照組的血管密集。

2．2 微血管在移植體內(nèi)的生長情況：實驗組移植體外周和中央部均可見多量新生血管，而外周為新生血管的“熱點”，空白對照組和實驗對照組新生血管數(shù)量較少且主要集中在移植體外周(圖5、6)。對術(shù)后第7天、14天、28天、42天及64天脂肪移植體進(jìn)行微血管的定量分析顯示，實驗組移植體新牛血管密度高于實驗對照組和空白對照組。

2．3 移植體存活情況：術(shù)后7天各組脂肪組織存活差別無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后14－64天，實驗組脂肪組織存活率均高于實驗對照組和空白對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子又被稱為血管滲透因了(VPF)。目前發(fā)現(xiàn)人的VEGF有6種單體形式：VEUP121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和VEGF206，大多數(shù)細(xì)胞優(yōu)先產(chǎn)生VEGF121、VEGF165和VEGF189，其中VEGF165是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖移行、增加后毛細(xì)血管和小靜脈等微小血管對大分子的通透性、調(diào)節(jié)血管緊張性、促進(jìn)胚胎期血管形成，對維持血管的正常狀態(tài)和完整性有重要意義。ANG-1是Davis在1996年利用分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種由498個氨基酸所組成、分子量為70000kd的糖蛋白，在血管平滑肌細(xì)胞或其他血管周圍細(xì)胞表達(dá)。

ANG－1的主要生物學(xué)功能有：①促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移、趨化和聚集，形成原始的管狀結(jié)構(gòu)；②抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；③維持并穩(wěn)定血管作用；④抗炎作用。與其結(jié)合的Tie2受體是特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和某些造血祖細(xì)胞酪氨酸激酶型受體，可作用于維持成熟血管的穩(wěn)定，并參與內(nèi)皮細(xì)胞新生血管化過程。郭杰等實驗證實了ANG－1可以提高自體脂肪移植的成活率。

脂肪組織游離移植以后經(jīng)歷了缺血和血運重建兩個過程。移植體與受體建立血液循環(huán)是組織存活的關(guān)鍵。血運建立一方面依靠從受體向移植體長入新生血管，另一方面依靠新生血管與原有血管吻合溝通。ANG在血管的再生中可與VEGF協(xié)同發(fā)揮作用：VEGF作用于血管形成的早期，促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成：ANG則作用于隨后的血管改建、塑形，促進(jìn)形成成熟且有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)。當(dāng)VEGF的作用存在時，ANG可增加毛細(xì)血管管徑、重建基膜、促內(nèi)皮細(xì)胞增生與遷移，刺激新生血管出芽；而當(dāng)VEGF的作用受抑制時ANG則加速內(nèi)皮細(xì)胞死亡及血管退行性變。王彪等研究發(fā)現(xiàn)Ang/Tie2體系與VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子在血管瘤增生退化過程中可能起協(xié)同的作用。我們在顆粒脂肪移植的實驗動物模型中應(yīng)用纖維蛋白原緩釋VEGF165，ANG協(xié)同VEGF發(fā)揮作用。HE染色后光鏡下觀察移植體組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：相比于空白對照組的大部分移植體纖維化，僅少量脂肪組織殘留；實驗組脂肪細(xì)胞存活率大，脂肪細(xì)胞形態(tài)接近正常脂肪組織，纖維組織間隔少，淋巴細(xì)胞浸潤輕，被膜較厚且完整。通過免疫組化法對微血管定性和定量分析及移植體剩余體積量測量表明：實驗組移植體新生血管密度及脂肪成活率高于空白對照組(P＜0.01)，說明VEGF可以促進(jìn)移植體血管化，提高移植體成活率；ANG可協(xié)同VEGF在脂肪移植早期加快移植體血供的重建，縮短脂肪移植體的缺血缺氧期，從而減輕組織壞死，提高脂肪移植的成活率。通過實驗組和空白對照組的觀察(P＞0.05)，纖維蛋白本身對血管生長無生物活性，只起藥物載體的作用。

VEGF是一種生物活性多肽，通過旁分泌或自分泌發(fā)揮生理作用，VEGF需持續(xù)作用于脂肪移植體及周圍受區(qū)組織才能起到良好效果。纖維蛋白原在凝血酶的作用下形成纖維蛋白的過程中交聯(lián)成海綿狀網(wǎng)，而海綿體可延長藥物的釋放時間。VEGF的最佳有效劑量決定于移植脂肪的組織量。在參考國內(nèi)外相關(guān)實驗研究的基礎(chǔ)上，我們在1m 脂肪顆粒中應(yīng)用1μg VEGF，證明可以取得良好效果。本實驗用5％纖維蛋白原20μl、125U/ml凝血酶10μl作為1μgVEGF的藥物載體，實踐證明：纖維蛋白原在凝血酶的作用下形成的纖維蛋白能充分地結(jié)合VEGF，使VEGF緩慢持續(xù)地釋放于移植體及其周圍，起到持續(xù)作用的效果。本實驗在如何更好地設(shè)計實驗方案證明ANG的協(xié)同作用，VEGF的最適劑量、ANG的最適濃度、浸泡的最適時間、加入的合適時機(jī)等方面尚待進(jìn)一步研究。